乙醛脱氢酶（ALDH）活性检测试剂盒说明书（紫外分光光度法）

产品内容：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 20mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂 80mg×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加入 6mL 蒸馏水溶解，-20℃分装保存；或者按比例现用现配。

试剂三：液体 1mL×1 支，4℃避光保存。

试剂四：液体 2mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：液体 3mL×1 瓶，4℃保存。

产品说明：

乙醛脱氢酶 (EC 1.2.1.10)是醛脱氢酶的一种，广泛存在于各种动物、植物和微生物体内。在辅酶 I 的存在下，它催化乙醇在内的某些一级或二级醇、醛或酮的脱氢反应。在人类和许多动物体内， 线粒体乙醛脱氢酶能把对生物体有害的醇类转化，所以在细胞解毒研究中乙醛脱氢酶受到高度关注；同时，乙醛脱氢酶在分子生物学以及相关疾病的检测方面有较广泛的研究应用。

乙醛脱氢酶催化乙醛和 NAD+转化为乙酸和NADH，利用 NADH 在 340nm 处吸光值的变化即可计算得到乙醛脱氢酶的活性。

试验中所需的仪器和试剂：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

细胞：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g， 4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

液体：直接检测。

二、测定步骤：

1、 紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、 将试剂一 37℃（哺乳动物）或 25℃（其他物种）预热 15min。

3、 操作表：

三、ALDH 酶活计算

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为 1 个酶活单位。

ALDH 酶活（U/mg prot）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 804×△A÷Cpr

2、按样本质量计算

酶活定义：每克样品每分钟生成 1nmol  的 NADH 定义为 1 个酶活单位。

ALDH 酶活（U/g 鲜重）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 804×△A÷W

3、按照细胞数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细胞每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为 1 个酶活单位。

ALDH 酶活（U/10⁴ cell）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个）÷T= 804×△A÷细胞数量（万个）

4、按液体体积计算

酶活定义：每 mL 样本每分钟生成 1nmol 的 NADH 定义为 1 个酶活单位。

ALDH 酶活（U/mL）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反总÷V 样÷T= 804×△A

ε：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积， 0.001L；V 样：反应体系中样本体积，0.2mL；V 样总：提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL， 需自行测定；W：样本质量，g；T：反应时间：1min；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1、空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，其 OD 值不超过 0.3，变化不超过 0.01。

2、△A 大于 1 时，建议将样品稀释后再进行测定。当△A 小于 0.01 时，可以延长反应时间（5min 或 10min）来测定。

3、试剂五沸点低，在使用时保持低温以保证正确的吸取量。