甲醛脱氢酶（FDH）试剂盒说明书（分光光度法）

货号：LE-1-345

正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

甲醛是一种能与蛋白质、核酸和脂类产生非特异性反应的活泼化合物，对所有生物都具有很高毒性。甲醛脱氢酶作为含锌中等链醇脱氢酶（ADH）的家庭成员之一，广泛存在于原核和真核生物中，该酶能利用 NAD⁺作为辅酶，将有毒的甲醛氧化，是甲醛氧化途径中的关键酶。

测定原理

甲醛脱氢酶催化甲醛和 NAD⁺ 产生 NADH，在 340nm 处的吸光值会增加，测定 340nm 处的吸光值变化，可计算得到甲醛脱氢酶的活性。

自备实验用品及仪器

天平、离心机、分光光度计、1mL 玻璃比色皿、蒸馏水。

试剂组成和配制

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 30mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 15mL 水溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃ 保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入 3mL 水溶解待用。

试剂四：液体 3mL×1 瓶，4℃避光保存。

FDH 提取

1、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 20min。

2、细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1  的比例（建议 500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）;然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3、液体：直接检测。

测定操作表

1、分光光度计预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、操作表

在比色皿中加入如下试剂

混匀，于 340nm 下测定初始吸光值A1 与 5min 后的吸光值 A2，△A=A2-A1。若样本数量较多，可将试剂按比例配成工作液使用。

FDH 酶活计算:

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：每毫克蛋白每分钟催化还原 1nmol NAD⁺ 的酶量为 1 个酶活单位。

FDH 酶活（nmlo/min/mg prot）=[△A÷ (ε×d) ]×V 反总÷（V样×Cpr）÷T

= 322×△A÷Cpr

2、按样本质量计算

酶活定义：每克样品每分钟催化还原 1nmol NAD⁺ 的酶量为 1 个酶活单位。

FDH 酶活（nmlo/min/mg 鲜重）=[△A÷ (ε×d) ]×V 反总÷（V样×W÷V 样总）÷T

= 322×△A÷W

3、按照细胞数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细胞每分钟催化还原 1nmol NAD⁺ 的酶量为 1 个酶活单位。

FDH 酶活（nmlo/min/10⁴ cell）=[△A÷ (ε×d) ] ×V 反总÷（V 样÷V 样总×细胞数量（万个））÷T

= 322×△A÷细胞数量

4、按液体体积计算

酶活定义：每 ml 样本每分钟催化还原 1nmol NAD⁺ 的酶量为 1 个酶活单位。

FDH 酶活（nmlo/min/ml）= [△A÷ (ε×d) ] ×V 反总÷V 样÷T

=322×△A

ε ：NADH 微摩尔消光系数，6.22×10^-3  L/µmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，1ml； V 样：反应体系中样本体积，0. 1ml；V 样总：加入提取液体积，1ml；T ，反应时间，5min；Cpr：样本蛋  白浓度，mg/ml；W：样本质量，g