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产品名称:NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:LE-1-336,LE-2-336

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-336

NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒

紫外分光光度法

50/48

320

LE-2-336

NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)测试盒

微量法

100/96

600

NADP-苹果酸脱氢酶(NADP-MDH)试剂盒说明书(紫外分光光度法

测定意义:

MDH EC 1.1.1.37)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH TCA循环的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸;相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙酸是重要的中间产物, 连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要的角色,包括线粒体的能量代谢、 苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅酶特异性,MDH 分为 NAD-依赖的 MDH NADP-依赖MDHNADP-MDH 主要存在于真核细胞中。

测定原理:

NADP-MDH 催化 NADPH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

试剂一、提取液 60 mL×1 瓶,在 4℃保存;

试剂二、液体 50 mL×1 瓶,在 4℃保存;

试剂三、粉剂×2 支,-20℃保存;临用前加入 300μL 蒸馏水,现配现用;

试剂四、粉剂×2 支,-20℃保存;临用前加入 300μL 蒸馏水,现配现用。

样本测定的准备:

1、细菌、细胞或组织样品的制备:

细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~10001的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。

组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)15~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、 将试剂二在 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 10min 以上。

3、 操作表:

试剂名称(μL

测定孔

样本

20

试剂二

760

试剂三

10

试剂四

10

将上述试剂按顺序加入1 mL石英比色皿中,混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸光度A1 和反应 1min 后的吸光度 A2,计算 ΔA=A1-A2

注意:

A1-A2 大于 0.5,需将样本用提取液稀释,使 A1-A2 小于 0.5,可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

NADP-MDH 活力单位的计算:

1、血清(浆)NADP-MDH 活力的计算

单位的定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDHnmol/min /mL=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷V 样÷T=6430×ΔA

2、组织、细菌或细胞中 NADP-MDH 活力的计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDHnmol/min /mg prot=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr) T=6430×ΔA÷Cpr

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织每分钟消耗 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-MDHnmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V样÷V样总)÷T=6430×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟消耗1 nmolNADPH定义为一个酶活力单位。

NADP-MDHnmol/min /104cell=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷ (V样÷V样总×500)÷T=12.86×ΔA

V 反总:反应体系总体积,8×10 -4 L;ε:NADPH 摩尔消光系数,6.22×10 3 L / mol /cmd:比色皿光径,1cmV 样:加入样本体积,0.02 mLV 样总:加入提取液体积,1 mLT:反应时间,1 minW:样本质量,gCpr:样本蛋白质浓度,mg/mL500:细胞或细菌总数,500 万。


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