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产品名称:NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:LE-1-335,LE-2-335

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-335

NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测试盒

紫外分光光度法

50/48

280

LE-2-335

NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)测试盒

微量法

100/96

550

NAD-苹果酸脱氢酶(NAD-MDH)活性检测试剂盒说明书(紫外分光光度法                                                                  

产品内容:

提取液:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 40mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×2 支,-20℃保存;临用前加入 360μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存;

试剂三:粉剂×2 支,-20℃保存;临用前加入 327μL 双蒸水,用不完的试剂仍-20℃保存。

产品说明:

MDH(EC 1. 1. 1.37)广泛存在于动物、植物、 微生物和培养细胞中,线粒体中 MDH 是 TCA 循环 的关键酶之一,催化苹果酸形成草酰乙酸; 相反,胞浆中 MDH 催化草酰乙酸形成苹果酸。草酰乙 酸是重要的中间产物,连接多条重要的代谢途径。因此,MDH 在细胞多种生理活动中扮演着重要 的角色,包括线粒体的能量代谢、苹果酸-天冬氨酸穿梭系统、活性氧代谢和抗病性等。根据不同的辅 酶特异性, MDH 分为NAD-依赖的MDH和NADP-依赖的MDH ,细菌中通常只含有NAD-MDH ,在真 核细胞中,NAD-MDH 分布于细胞质和线粒体中。

NAD-MDH 催化 NADH 还原草酰乙酸生成苹果酸,导致 340nm 处光吸收下降。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。

操作步骤:

一、样品测定的准备:

1、细菌、细胞样品的制备:细菌或培养细胞: 收集细菌或细胞到离心管内,弃上清,按照每 200 万细菌或细胞加入 400μL 提取 液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s ,间隔 10s ,重复 30 次),8000g4℃离心 10min , 取上清,置冰上待测。

2、组织: 称取约 0.05g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆; 8000g 4℃离心 10min ,取上清,置 冰上待测。

3、血清(浆) 样品:直接检测。

二、测定步骤和加样表:

紫外分光光度计提前预热 30min ,调节波长至340nm ,蒸馏水调零,试剂一37℃预热 15min。

试剂名称(µL)

测定管

空白管

样本

20

-

蒸馏水

-

20

试剂一

760

760

试剂二

10

10

试剂三

10

10

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,充分吸打混匀后立即在 340 nm 波长下记录初始吸 光度 A1 和反应 1min 后的吸光度 A2 ,尽量保持反应温度为 37℃ 。计算ΔA=A1-A2 。记录ΔA 测定、 ΔA 空白。

三、NAD-MDH 活力单位的计算:

1 、血清(浆) NAD-MDH 活力的计算

单位的定义: 每毫升血清(浆) 在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

NAD-MDH U/mL)=(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总÷V 样本÷T =6430 ×(ΔA 测定-ΔA 空白)          

2 、组织中 NAD-MDH 活力的计算:

1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义: 每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

NAD-MDH(U/mg prot)=(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总÷(V 样本×Cpr)÷T= 6430 ×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷Cpr

2) 按样本鲜重计算:

单位的定义: 每 g 组织在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

NAD-MDH(U/g  鲜重) =(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总÷(W÷V 提取×V 样本)÷T=6430×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷W

3 细菌或培养细胞中 NAD-MDH 活力的计算:

1) 按样本蛋白浓度计算:

单位的定义: 每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟消耗 1nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。 

NAD-MDH(U/mg prot)=(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷ ( ε×d)×V 反总÷(V 样本×Cpr)÷T= 6430×(ΔA 测定-ΔA 空白) ÷Cpr

2) 按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。 

NAD-MDH(U/104 cell)=(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总÷(500×V 样本)÷T=13×(ΔA 测定-ΔA 空白)

V 反总: 反应总体积,0.8mL;V 样本: 加入样本体积,0.02mL;ε:NADH 摩尔消光系数,   6.22×10-3mL/nmoL/cm;d:比色皿光径,1cm;T:反应时间,1min;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL; 500:细菌或细胞密度,104/mL

注意事项:

1 、粗酶液的提取必须在 0℃- 4℃中操做完成,以防止酶变性失活。

2 、实验时,试剂二、试剂三和样本在冰上放置,以免变性和失活。

3 、当初始读值小于 0.7 或者 ΔA 大于 0.5 时建议稀释后测量。

4 、建议一人加样一人比色。

5 、空白管测 1-2 管即可。


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