细胞色素 b5（Cytochrome b5）含量测定试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的同工酶，在外源物质代谢中具有重要作用，尤其是药物和毒物的代谢。细胞色素 P450 和细胞色素 b5 是 P450 酶系的两个血红素蛋白，其比值的变化与 P450 代谢活性密切相关。

测定原理：

氧化型细胞色素 b5 经连二亚硫酸钠还原后，在 424nm 处有最大吸收峰，通过测定 424nm 和 490nm 处吸光值的差异，即可计算出细胞色素 b5 的含量。

自备实验用品及仪器：

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×2 瓶，4℃保存。临用前各加 100mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，4℃避光保存。

工作液配制：临用前配制，戴一次性手套，小心打开试剂三瓶盖，加试剂二 20mL 充分溶解，4℃避光可保存 1 周。

样品中细胞色素 b5 提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10

000g 4℃离心 30min，取上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体：100 000g，4℃离心 60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。

4、待测液：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，盖紧后充分震荡溶解，即待测液，该待测液需当天测定。

细胞色素 b5 含量测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min。

2. 工作液置于 25℃水浴中预热 30 min。

3. 空白管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 10 μ L 蒸馏水，200μ L 工作液，室温静置 2 min，424nm 和 490nm 处吸光值，424nm 处吸光值记为A 空白管 1，490nm 处吸光值记为 A 空白管 2。△A 空白管= A 空白管 1- A 空白管 2

4. 测定管：取 1mL 玻璃比色皿，加入 10 μ L 待测液，200μ L 工作液，室温静置 2 min，424nm 和 490nm 处吸光值，424nm 处吸光值记为A 测定管 1，490nm 处吸光值记为 A 测定管 2。

△A 测定管= A 测定管 1- A 测定管 2。

注意：只需要做一个空白管。

样品细胞色素 b5 含量计算公式：

      ε  ：还原型细胞色素 b5 纳摩尔消光系数，171×10-3 L/nmol/cm；d：96 孔板光径（cm），0.5cm； V 反总：反应体系总体积，210 μ  L =2.1×10-4  L；Cpr：待测液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定；V 样：加入反应体系中待测液体积，10 μ L=0.01 mL；V 样总：待测液总体积，0.5 mL； W：样品质量（g）