红霉素-N-脱甲基酶（ERND）活性测定试剂盒说明书（微量法）
测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组主要存在于肝脏的酶系，在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物的代谢，具有重要作用。ERND 在 P450 酶系中相当于 CYP2B 亚型，与药物代谢的去甲基化密切相关。CYP2B 具有催化底物形成非活性易于排泄的代谢产物而具有解毒作用，也可使某些药物经 CYP2B 代谢活化。

测定原理：

ERND 催化红霉素释放甲醛，通过 Nash 比色测定甲醛含量，即可计算出 ERND 活性。

自备实验用品及仪器：

普通离心机，超速离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水和冰。

试剂组成和配置：

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水溶解。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 管，4℃保存。临用前加 1mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂四：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 0.5mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前，加蒸馏水 4.5mL 充分溶解。

试剂六：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂七：液体×1 瓶，4℃保存。

标准液：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前取 1.5mL EP 管，加入 10μ l 标准液，加 990μ l 蒸馏水，混匀即为 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1mL 试剂一，冰上充分研磨，10

000g 4℃离心 30min，取上清液，转入超速离心管中。

2、粗制微粒体：100 000g，4℃，离心 60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5mL，充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30 min。

3. 对照管：取 0.5mL EP 管，加入 10μ L 粗酶液，170μ L 试剂二，10μ L 试剂三，10μ L 蒸馏水，混匀后置于 37℃水浴保温 30min；立即加入 35μ L 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μ L 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新的 EP 管，加入100μ L 上清液，100μ L 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为A 对照管。

4. 测定管：取 0.5mL EP 管，加入 10μ L 粗酶液，170μ L 试剂二，10μ L 试剂三，10μ L 试剂四，混匀后置于 37℃水浴保温 30min；立即加入 35μ L 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μ L 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新 EP 管，加入100μ L 上清液，100μ L 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为A 测定管。

5. 标准管：取 0.5mL EP 管，加入 100μ L 标准品，100μ L 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min， 然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为A 标准管。

注意：每个样品都需要做对照管。

ERND 活性计算公式：

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、按照蛋白浓度计算:

活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T

= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr。

2、按照样本质量计算:

活性单位定义：37℃下，每分钟每克样品催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

ERND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（W×V 样）÷T

= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W

C 标准品：0.05 mmol/L=50μ mol/L；V 标准品：100μ L=1×10^-4 L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V 样：加入粗酶液体积， 10μ  L=0.01mL；T：催化反应时间（min），30min。

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下
1、按照蛋白浓度计算:
活性单位定义：37℃下，每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
ERND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T

C 标准品：0.05 mmol/L=50μ mol/L；V 标准品：100μ L=1×10^-4 L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒；W：样品质量，g；V 样：加入粗酶液体积， 10μ  L=0.01mL； T：催化反应时间（min），30min