正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

TH 位于线粒体的内膜上，又称为线粒体复合体六，催化 NADH+NADP⁺和NAD⁺+NADPH 相互转化，调节线粒体NAD(H)和 NADP(H)平衡。把逆向反应称为TH-2，催化NADPH和NAD⁺生成NADP⁺和 NADH。

测定原理

NADH和NADPH均在340nm有特征吸收，因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸（APAD⁺）替代NAD⁺，TH-2催化APAD⁺还原生成APADH，APADH在375nm有特征光吸收，测定375nm光吸收的增加速率，来计算TH-2活性。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一：液体 100mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂二：液体 50mL×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：液体 18mL×1 瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；

样本的前处理：

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离：

① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞，加入1mL试剂一，用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

② 将匀浆600g，4℃离心 5min。

③ 弃沉淀，将上清液移至另一离心管中，11000g，4℃离心10min。

④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白，可用于测定从线粒体泄漏的TH-2（此步可选做）。

⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体，加入500uL试剂二，超声波破碎（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10秒，重复30次），用于TH-2活性测定。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至375nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1）工作液的配制：临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min；现配现用；

（2）在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL工作液，混匀，立即记录375nm处初始吸光值A1和10min 后的吸光值 A2，计算ΔA=A2-A1。

TH-2 活性计算

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T

=149×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V样÷V样总)÷T

=74.5×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2活性（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.149×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 ^-4 L；ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×10 ³ L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b.用96孔板测定的计算公式如下

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg组织蛋白每分钟产生1nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/mg prot）=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T

=298×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g组织每分钟产生1nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/g 鲜重）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(W×V样÷V样总) ÷T=149×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol APADH定义为一个酶活性单位。

TH-2 活性（nmol/min/10⁴cell）=[ΔA×V反总÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V样÷V样总) ÷T=0.298×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10 ^-4 L；ε：APADH 摩尔消光系数，6.7×10 ³ L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，0.5mL；T：反应时间，10 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。