UDPG焦磷酸化酶（UPG）测试盒说明书(微量法)
测定意义

UDPG 焦磷酸化酶是生物体糖原合成过程中的关键酶。在葡萄糖合成糖原前催化葡萄糖活化，将 1-磷酸葡萄糖与 UTP 分子合成为 UDP-葡萄糖（UDPG）。

测定原理

UGP 可逆催化反应生成 1 磷酸葡萄糖，在磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶作用下将 NADP 转化为NADPH，340nm 的吸光值增加速率反映了 UGP 活性。

自备实验用品及仪器

天平、低温离心机、研钵、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板

试剂组成和配制

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃ 保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃ 保存，禁止反复冻融。

试剂四：粉剂×1 瓶，-20℃保存。临用前加 2mL 蒸馏水充分溶解；用不完的试剂分装后-20℃ 保存，禁止反复冻融。

试剂五：液体 2mL×1 瓶，4℃保存。

酶液提取

1、组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g，加入 1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。

2、细胞：按照细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1  的比例（建议 500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心 10min，取上清置冰上待测。

3、液体：直接检测。

测定操作

1、紫外分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μL 试剂一，20μL 试剂二，20μL 试剂三，20μL 试剂四，20μL 试剂五，20μL 粗酶液，充分混匀，记录 340nm 处 30s 的吸光值 A1 和 330s 的吸光值 A2，△A=A2-A1

计算公式

a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

(2) 按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷W

(3)按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴ 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=321.54×ΔA÷细胞数量

(4)按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /mL）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T=321.54×ΔA

      V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g

b. 使用 96 孔板测定的计算公式如下

（1） 按照样本蛋白浓度计算

酶活单位定义：每毫克组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

酶活单位定义：每克组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /g 鲜重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643.08×ΔA÷W

（3） 按照细胞数量计算

酶活单位定义：每 10⁴ 个细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /10⁴ cell）= ΔA÷（ε×d）×V 反总÷(V 样×细胞数量÷V 样总) ÷T=643.08×ΔA÷细胞数量

（4） 按照液体体积计算

酶活单位定义：每毫升液体每分钟消耗 1 nmol 的 NADP 定义为一个酶活力单位。

UGP（nmol/min /mL）=ΔA÷（ε×d）×V 反总÷V 样÷T=643.08×ΔA

      V 反总：反应体系总体积，0.2mL；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g