糖原磷酸化酶 b（GPb）试剂盒说明书（微量法）

测定意义：

糖原磷酸化酶（Glycogen phosphorylase，GP，EC 2.4.1.1)）是糖原分解代谢的关键酶，使糖原分子从非还原端逐个断开 α-1，4-糖苷键移去葡萄糖基，释放 1-磷酸葡萄糖，直至临近糖原分子 α-1，6-糖苷键分支点前 4 个葡萄糖基处。GP 分为有活性的糖原磷酸化酶 a（GPa） 和无活性的糖原磷酸化酶 b（GPb）两种形式。GPb 在一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）存在下可被激活。

测定原理：

GP 催化糖原和无机磷产生葡萄糖残基生成糖原和 1-磷酸葡萄糖，磷酸葡萄糖变位酶和 6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步依次催化 NADP 还原生成 NADPH，在 340nm 下测定 NADPH 上升速率，即可反映GP 活性。添加一定浓度的腺苷酸（5，-AMP）时测定 GP（GPa 和 GPb）活性，未添加腺苷酸（5，-AMP）时测定GPa 活性，GP 活性－GPa 活性得到 GPb 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 16 mL×1 瓶， 4℃保存； 

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存； 试剂四：粉剂×1 支， -20℃保存；

试剂五：粉剂×1 支， -20℃保存； 

样本的前处理：

按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、 分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零；

2、 工作液的配制：临用前将试剂二转移到试剂一中混合溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、 试剂三的配制：临用前在试剂三瓶中加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

4、 试剂四的配制：临用前在试剂四瓶中加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

5、 试剂五的配制：临用前在试剂五管中加入 500μL 蒸馏水充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

6、 将工作液、试剂三、试剂四和试剂五置于 37℃预热 5 分钟；

7、 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三、10μL 试剂四、10μL 蒸馏水和160μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处 5min 后的 A1 和 10min 后的吸光值 A2， 计算 ΔAGPa=A2-A1。

8、 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本、10μL 试剂三、10μL 试剂四、10μL 试剂五和160μL 工作液，立即混匀，记录 340nm 处 5min 后的 A3 和 10min 后的吸光值 A4， 计算 ΔAGP=A4-A3。

注意：由于每个样本需要同时测一个GP（GPa 和 GPb）活性和一个 GPa 活性，因此本试剂盒 100 管测 48 个样本。

GPb 活性计算：

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb （ nmol/min/mg prot ） ＝ [(ΔAGP － ΔAGPa)×V 反总÷ （ ε×d ） ×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb（ nmol/min/g 鲜重） ＝[(ΔAGP－ ΔAGPa)×V 反总÷（ ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=643×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

      V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。

b. 用 96 孔板测定的计算公式如下：

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb （ nmol/min/mg prot ） ＝ [(ΔAGP － ΔAGPa)×V 反总÷ （ ε×d ） ×10⁹]÷(V 样×Cpr)÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位定义：每 g 组织每分钟产生 1nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

GPb（ nmol/min/g 鲜重） ＝[(ΔAGP－ ΔAGPa)×V 反总÷（ ε×d）×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=1286×(ΔAGP－ΔAGPa)÷W

      V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g。