产品名称:NAD激酶(NADK)测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:YX-C-A010,YX-W-A010
免费咨询:0551-66107970
货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-A010 |
NAD激酶(NADK)测试盒 |
可见分光光度法 |
50管/48样 |
600 |
YX-W-A010 |
NAD激酶(NADK)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
1150 |
NAD 激酶(NAD kinase, NADK)试剂盒说明书(可见分光光度法)
规格:50 管/48 样
注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
NADK(EC 2.7.1.23)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,是目前所发现的生物体内惟一能够催化 NAD+磷酸化生成NADP+的酶,可催化NAD(H)以ATP或无机多聚磷酸[poly(P)]作为磷酰基供体进行磷酸化反应,生成 NADP(H)。因此,NAD激酶在合成 NADP(H)
以及调节NAD(H)与 NADP(H)的平衡上具有重要作用。
测定原理:
NADK催化NAD +磷酸化,生成 NADP+;NADP +可被6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原为NADPH;NADPH 通过PMS的递氢作用,还原氧化型噻唑蓝(MTT),通过在600 nm下测定MTT的还原速度(吸光值的变化)可反映出NADK活性的大小。
需自备的仪器和用品:
可见分光光度计、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL玻璃比色皿和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体20mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:液体50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存;
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存;
试剂五:粉剂×1 瓶, -20℃保存;
样本测定的准备:
1、细菌、细胞或组织样品的制备:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率20%或 200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,
加入1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 600nm,蒸馏水调零。
2、将试剂一和试剂二37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴15min以上。
3、工作液Ⅰ的配制:在试剂三中加入16mL试剂一,充分混匀待用;现配现用。
工作液Ⅱ的配制:在试剂四中加入22mL试剂二,充分混匀待用;溶解后 4℃保存一周。
工作液Ⅲ的配制:在试剂五中加入22mL试剂二,充分混匀待用;溶解后 4℃保存一周。
4、加样表
试剂名称(μL) |
测定孔 |
样本 |
80 |
工作液Ⅰ |
320 |
充分混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴 15min,立即煮沸2min(盖紧,防止水分散失)冰浴冷却,10000g,25℃离心 10min,取上清
上清液 |
100 |
工作液Ⅱ |
440 |
工作液Ⅲ |
440 |
加完试剂混匀后立即在 600nm下测定 30 秒的吸光值 A1 和 3 分钟 30 秒时的吸光值 A2,计算△A= A2-A1
NADK 活性计算:
标准条件下测定的回归方程为 y = 0.002463x +0.004;x 为 NADP 标准品浓度(nmol/mL),y为吸光值。
(1)按样本蛋白浓度计算:
单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol NADP 定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /mg prot)=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(V1×Cpr)÷T
=135.3×(△A - 0.004)÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按样本鲜重计算:
单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /g 鲜重)=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(W×V1÷V2)÷T
=135.3×(△A - 0.004)÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol NADP定义为一个酶活力单位。
NADK(nmol/min /10 4 cell)=[406×(△A - 0.004)×V1]÷(500×V1÷V2)÷T
=0.271×(△A -0.004)
V1:加入反应体系中样本体积,0.08mL;V2:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,3min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;;500:细胞或细菌总数,500 万。
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