氨基比林-N-脱甲基酶（AND）活性测定试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

细胞色素 P450 酶是一组在外源物质代谢中，尤其是药物和毒物，具有重要作用的酶系。AND 作为 P450 酶系的重要一员，相当于 CYP3A4 亚型，与药物的去甲基化反应密切相关。

测定原理：

AND 催化氨基比林释放甲醛，通过 Nash 比色法测定甲醛含量，即可计算出 AND 活性。

自备实验用品及仪器：

普通离心机，超速离心机、水浴锅、可调式移液枪、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水、无水乙醇和冰。

试剂组成和配制：

试剂一：粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加 100mL 蒸馏水充分溶解。

试剂二：液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 管，4℃避光保存。临用前加入 1mL 无水乙醇，充分溶解。

试剂四：粉×1 管，4℃保存。临用前加入 0.5mL 蒸馏水，充分溶解。

试剂五：粉剂×1 瓶，室温保存。临用前加蒸馏水 4mL 充分溶解。

试剂六：液体×1 瓶，室温保存。

试剂七：液×1 瓶，4℃保存。

标准液：液体×1 瓶，-20℃保存。临用前取 1.5mL EP 管，加入 10μ l 标准液，加 990μ l 蒸馏水，混匀即为 0.05 mmol/L 标准甲醛溶液，4℃保存。

粗酶液提取：

1、除去细胞核，线粒体等大分子物质：称约 0.5g 组织，加入 1 mL 试剂一，冰上充分研磨，

10 000g 4℃离心 30min，取上清液转入超速离心管。

2、粗制微粒体：4℃，100 000g，离心 60min，弃上清液。

3、除血红蛋白等杂质：向步骤 2 的沉淀中加 1mL 试剂一，盖紧后充分震荡溶解，100 000g 离心 30min，弃上清液。

4、最终微粒体：向步骤 3 的沉淀中加试剂二 0.5 mL，盖紧后充分震荡溶解，即粗酶液，待测。该待测液需当天使用。

AND活性测定操作：

1. 分光光度计/酶标仪预热 30 min，调节波长到 412 nm，蒸馏水调零。
2. 试剂二置于 37℃水浴中预热 30min。
3. 对照管：取 1 支EP 管，加入 10μ L 粗酶液，170μ L 试剂二，10μ L 试剂三，10μ L 蒸馏水， 混匀后置于 37℃水浴保温 30min；立即加入 35μ L 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μ L 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取新的 EP 管，加入 100μ L 上清液，100μ L 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为A 对照管。
4. 测定管：取 1 支EP 管，加入 10μ L 粗酶液，170μ L 试剂二，10μ L 试剂三，10μ L 试剂四， 混匀后置于 37℃水浴保温 30min；立即加入 35μ L 试剂五，混匀后置于冰浴中 5min；取出后加入 35μ L 试剂六，混匀后室温静置 5min；室温 8000rpm 离心 5min；取 1 支新 EP 管，加入100μ L 上清液，100μ L 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为A 测定管。
5. 标准管：取 1 支EP 管，加入 100μ L 标准品，100μ L 试剂七，混匀后 60℃水浴 10min，然后取出，用冷水冷却 5min，于 412nm 测定光吸收，记为A 标准管。
注意：每个样品都需要做对照管。
AND活性计算：
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下
（1） 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。

AND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品× V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管× 稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷Cpr。
（2） 按样本质量计算
活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
AND 活性(nmol/min/g 鲜重 ) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(V 样÷V 样总×W)÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管÷W。
      C 标准品：0.05 mmol/L=50μ mol/L；V 标准品：500μ L=0.0005 L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入粗酶液体积，50μ L=0.05mL；V 样总： 提取液体积，0.5mL；T：催化反应时间（min），30min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1） 按蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每分钟每毫克蛋白催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
AND 活性(nmol/min/mg prot) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管× 稀释倍数÷（Cpr×V 样）÷T= 45×（A 测定管－A 对照管）÷ A 标准管÷ Cpr。
（2） 按样本质量计算
活性单位定义：37℃中每分钟每克组织催化产生 1nmol 甲醛为 1 个酶活单位。
AND 活性(nmol/min/g 鲜重) = C 标准品×V 标准品×（A 测定管－A 对照管）÷A 标准管×稀释倍数÷(V 样÷V 样总×W)÷T
= 45×（A 测定管－A 对照管）÷ A 标准管÷W。
      C 标准品：0.05 mmol/L=50μ mol/L；V 标准品：500μ L=0.0005 L；稀释倍数：V 反总÷V 上清液=（50+850 +50+50+175+175）÷500=2.7；Cpr：粗酶液蛋白质浓度（mg/mL），需要另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒；V 样：加入粗酶液体积，50μ L=0.05mL；V 样总： 提取液体积，0.5 mL；T：催化反应时间（min），30min。
注意事项：
1、粗酶液需在当日完成测定，如需保存，则向粗酶液提取步骤 3 的沉淀中加 0.5ml 20%的甘油，分装后，-80℃保存；
2、试剂三和试剂四需临用前配制，如当天没有用完，4℃避光保存，可用 1 周；
3、粗酶液可直接用于蛋白浓度测定，建议用 BCA 法测蛋白含量