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产品名称:NADH氧化酶(NOX)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:LE-1-334,LE-2-334

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-334

NADH氧化(NOX)测试盒

分光光度法

50/48

450

LE-2-334

NADH氧化酶(NOX)测试盒

微量法

100管/96

880

NADH氧化酶(NOX)试剂盒说明书(分光光度法

货号:LE-1-334

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

NOX(EC 1.6.99.3)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,可在氧气存在下,直接将 NADH 氧化为 NAD。该酶不仅参与 NAD 的再生,而且与免疫反应密切相关。

测定原理:

NOX 能够将 NADH 氧化为 NAD,NADH 的氧化与 2,6 二氯酚靛蓝(DCPIP)的还原相偶联, 蓝色的 DCPIP 被还原为无色的 DCPIP,在 600nm 下测定蓝色 DCPIP 的还原速率计算出NADH 氧化酶活性的大小。

需自备的仪器和用品:

可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、 1mL  玻璃比色皿、研钵、冰、蒸 馏水

试剂的组成和配制:

试剂一: 液体 50mL×1 瓶,-20℃保存。

试剂二: 液体 10mL×1 瓶,-20℃保存。

试剂三: 液体 1mL×1 瓶,-20℃保存。

试剂四: 液体 50mL×1 瓶,4℃保存。

试剂五: 液体 6 mL×1 瓶,4℃保存。

试剂六 :粉剂×2 瓶,-20℃保存; 临用前每瓶加入 5mL 蒸馏水; 用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

①   准确称取 0.1g 组织或收集 500 万细胞,加入 1mL 试剂一和 10uL  试剂三 ,用冰浴匀浆 器或研钵匀浆。

②   将匀浆 600g,4℃离心 5min。

③   弃沉淀,将上清液移至另一离心管中, 11000g4℃离心 10min。

④   上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的 NOX(此步可选做)。

⑤   步骤 ④ 中的沉淀即为线粒体,加 200uL 试剂二和 2uL  试剂三 ,超声波破碎(冰浴, 功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10 秒,重复 30 次),用于 NOX 活性测定。

血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 600nm,蒸馏水调零。

2、样本测定

1) 试剂四、试剂五和试剂六于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min。

2) 在 1mL 石英比色皿中加入 40μL 样本、700μL 试剂四、 100μL 试剂五和 160μL 试剂六,混匀,记录 600nm 处 20s 时吸光值 A1 和  1min20s 后的吸光值 A2,计算 ΔA=A1-A2。

NOX 活力单位的计算

1、血清(浆)NOX 活力的计算:

单位的定义:每 mL 血清(浆)在每mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOXU/mL=ΔA×V 反总÷V 样÷0.01÷T

=2500×ΔA

2组织、细菌或细胞中 NOX 活力的计算:

1)按样本蛋白浓度计算:

单位的定义:每 mg 组织蛋白在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX(U/mg prot)=ΔA×V 反总÷(V 样×Cpr)÷0.01÷T

=2500×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2)按样本鲜重计算:

单位的定义:每 g 组织在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX(U/g  鲜重)=ΔA×V 反总÷(W× V 样÷V 样总)÷0.01÷T

=505×ΔA÷W

3)按细菌或细胞密度计算:

单位的定义:每 1 万个细菌或细胞在每 mL 反应体系中每分钟 A600 变化 0.01 定义为一个酶活力单位。

NOX(U/104 cell)=ΔA×V 反总÷(500×V 样÷V 样总)÷0.01÷T

=1.01×ΔA

V 反总:反应体系总体积, 1mL; V 样:加入样本体积,0.04mL;V 样总:加入提取液体  积,0.202 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量;500: 细胞或细菌总数,500 万。


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