脂氧合酶（Lipoxygenase, LOX）活性测定试剂盒说明书（紫外分光光度法）

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一： 液体×1 瓶，4℃保存。

试剂二： 液体×1 瓶，4℃保存。

试剂三： 粉剂×1 瓶，4℃保存。临用前加入 5mL 试剂二，充分溶解。

产品说明：

LOX 广泛存在于植物组织中，催化不饱和脂肪酸氧化反应，导致膜脂过氧化。在植物的生长发 育、成熟衰老及逆境胁迫过程中具有重要作用。

LOX 催化亚油酸氧化，氧化产物在 234nm 处有特征吸收峰； 测定 234nm 吸光度增加速率，来 计算 LOX 活性。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计、1mL 石英比色皿、可调式移液枪和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

按照组织质量（g）： 试剂一体积(mL)为 1：5~ 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织，加入 1mL 试 剂一） 进行冰浴匀浆。16000g ，4℃离心 20min ，取上清置冰上待测。

二、测定：

1.    分光光度计预热 30 min ，调节波长到 234 nm ，蒸馏水调零。

2.    试剂二在 25℃水浴中预热 30 min。

3.    空白管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 蒸馏水、800μL 试剂二和 100μL 试剂三，迅速混 匀后于 234nm 比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2。

4.    测定管：依次在 1mL 石英比色皿中加入 100μL 上清液、800μL 试剂二和 100μL 试剂三，迅速混 匀后于 234nm 比色，记录 15s 和 75s 的吸光值，分别记为 A3 和 A4。

注意：空白管只需测定一次。

三、LOX 活性计算公式：

（1）按照蛋白浓度计算

活性单位定义： 25℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为 1 个酶活单位。 

LOX (U/mg prot) = [(A4 －A3) －(A2 －A1)]×V 反总÷(Cpr×V 样)÷T×1000

= 10000×[(A4 －A3) －(A2 －A1)]÷Cpr

（2）按照样本质量计算

活性单位定义： 25℃中每克组织每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为 1 个酶活单位。

LOX (U/g) = [(A4 －A3) －(A2 －A1)]×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T×1000

= 10000×[(A4 －A3) －(A2 －A1)]÷W

Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL ，需另外测定，建议使用本公司BCA 蛋白质含量测定试剂盒； V 样： 加入反应体系中上清液体积，100μL=0. 1mL；V 反总： 反应总体积，1mL；V 样总： 上清液 总体积，1mL；W：样本质量，g；T：反应时间，1min。

注意事项：

1.    试剂三易自发氧化，从而导致空白管测定值偏高，必须临用前配制，并且当天使用完毕。

2.    样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日完成酶活性测定。