游离脂肪酸（FFA）测试盒说明书（微量法）

注意：正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定。

产品内容：

提取液：液体100mL×1瓶，室温保存。

试剂一：自备。实验前一天，取一个玻璃瓶，按照正庚烷：无水甲醇：氯仿=24:1:25的比例配置（自备），盖紧后混匀，室温保存。

试剂二：液体6mL×1瓶，室温保存。

试剂三：粉剂×2瓶，4℃保存。临用前在试剂瓶中加入13mL无水乙醇，充分溶解，4℃可保存一周。

标准品：粉剂×1瓶，10mg棕榈酸，室温保存。临用前把试剂转移到10mL玻璃瓶中，加入7.8mL氯仿充分溶解，即为5μmol/mL的棕榈酸标准溶液。

产品说明：

FFA既是脂肪水解的产物，又是脂肪合成的底物。血清中FFA的浓度与脂类代谢、糖代谢、内分泌功能有关。

FFA与铜离子结合形成脂肪酸铜盐，并溶于氯仿；利用铜试剂法测定铜离子含量，即可推算出游离脂肪酸含量。

自备仪器和用品：

研钵、冰、台式离心机、可调式移液枪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、一个25mL玻璃瓶、一个15mL玻璃瓶、正庚烷、无水甲醇、氯仿（三氯甲烷）、无水乙醇和蒸馏水。

操作步骤：

一、样品中FFA提取：

1、血清中FFA测定：将所取血液，室温静置1h后，于4℃离心机3500rpm离心15min，取上层血清置于-20℃冰箱保存，待测

2、组织中FFA含量测定：组织用生理盐水冲洗干净后，用吸水纸吸取表面水分，称取约0.1g，加入1mL提取液，匀浆后，8000rpm，4℃离心10min，取上清液，置冰上待测。

二、测定：

a. 分光光度计/酶标仪预热30min以上，调节波长到550nm，蒸馏水调零。

b. 试剂二在37℃水浴中预热30min以上。

c. 标准品的稀释：将标准品稀释成1、0.8、0.6、0.4、0.2、0.1、0.05μmol/mL。

d. 按下表在1.5ml离心管中加入相应试剂

三、FFA含量计算：

（1） 标准曲线的绘制：

以标准溶液的浓度为x轴，以ΔA标准（ΔA=A标准管-A空白管）为y轴，绘制标准曲线，得到方程y=kx+b。将ΔA（ΔA=A测定管-A对照管）带入方程得到x。

（2） 血清FFA含量

FFA含量（μmol/L）=1000x

（3） 组织FFA含量

（1） 按样本蛋白浓度计算

FFA含量（μmol/mg）=x÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

FFA含量（μmol/g鲜重）=x×V样总÷W

V样总：上清液总体积，1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g。

注意事项：

1. 试剂三配制应尽量晚配，可在操作到加入试剂二时，再配制试剂三。

2. 必须保证每管的震荡频率及时间一致。

3. 尽量在30min内完成测量。

4. 上层溶液不可以直接加入到96孔板内，并且测完后要密封好再丢弃。

5. 因所用试剂多数为有机溶剂，同一支吸头多次吸取会造成体积不准确，建议更换吸头。