磷脂酶D（Phospholipases D，PLD）试剂盒说明书（可见分光光度法）

产品内容：

提取液：液体50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体55mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂二：液体8mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：粉剂×1 瓶，-20℃避光保存。临用前加3mL无水乙醇充分溶解。

试剂四：液体35mL×1 瓶，4℃避光保存。

标准品：液体1mL×1 支，4℃避光保存。

产品说明：

磷脂酶D（EC3.1.4.4）即磷脂酰胆碱水解酶，是催化磷酸二酯键水解和碱基交换反应的一类酶的总称，广泛存在于高等动植物和细菌等多种生物体中，具有参与胞脂质代谢、信号转导、生物膜形成的抗逆境胁等生理功能。

磷脂酶D催化水解磷脂酰胆碱末端的磷脂酰二酯键生成磷脂酸和胆碱，胆碱在胆碱氧化酶催化作用下生成甜菜碱和过氧化氢，过氧化氢在过氧化氢酶的作用下将4-氨基安替比林和重蒸酚氧化成粉红色物质，在500nm处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、研钵、超速冷冻离心机、可见分光光度计、1 mL玻璃比色皿、恒温水浴锅，无水乙醇。

操作步骤：

一、酶液提取

1. 组织：按照质量（g）：提取液体积(mL)为1：5-10 的比例（建议称取约0.1g，加入1mL提取液）加入提取液，冰浴匀浆后于4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃，100000g离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL 试剂一。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500-1000：1 的比例（建议500万细胞加入1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞，功率300w，超声3 s，间隔7 s，总时间3min）；然后于4℃，10000g 离心5min，取全部上清于4℃、100000g 离心30min，弃上清，取沉淀溶于1mL 试剂一。

3. 血清：直接测定。

二、测定操作

三、酶活计算公式

1． 按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位（U）。

PLD活性（U/mg prot）= A测定管/A标准管×C标准÷Cpr÷T= 0.017 ×（A测定管/A标准管÷Cpr

2． 按照样本质量计算

    酶活性定义：每毫克蛋白每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位（U）。

    PLD 活性（U/g）= A测定管/A标准管×C 标准÷W÷T= 0.017 ×（A测定管/A标准管）÷W

3． 按照细胞数量计算

    酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位（U）。

    PLD 活性（U/10⁴ cell）= A测定管/A标准管×C 标准÷细胞数量÷T= 0.017 ×（A测定管/A标准管）÷细胞数量

4． 按照样本质量计算

    酶活性定义：每毫升血清每分钟水解磷脂酰胆碱产生1nmol 胆碱所需的酶量一个酶活力单位（U）。

    PLD 活性（U/mL）= A测定管/A标准管×C 标准÷T= 0.017 ×（A测定管/A标准管）

C 标准：标准品浓度，500nmol/L； Cpr：样品蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g/mL；T：反应时间，30min

注意事项：

1. 试剂三置于-20℃保存，临用前配制，配置好的试剂三置于4℃保存不超过7天。

2. 显色完成后，若有沉淀，于8000rpm，25℃离心5min 后取上清测定。

3. 吸光值不宜超过1，否则用试剂一将酶液进行稀释，并在计算公式中乘以稀释倍数。