乙醇含量测试盒说明书（微量法）

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

酒是含酒精（乙醇）饮料的统称，乙醇是酒的主要成分，是衡量酒质量的重要指标之一。我国是世界上最早发明酿酒的国家，也是酒类产品消费大国，其消费量居世界之首。因此， 快速、准确测定酒中乙醇含量，对于确保酒的质量和保护消费者的健康具有重大意义。

测定原理：

乙醇在乙醇脱氢酶的催化下氧化脱氢生成乙醛，同时，NAD 被还原生成 NADH，NADH 在1-mPMS 的作用下使 WST-8 显橙黄色，通过 450 nm 下测定吸光值变化可测得乙醇含量。

需自备的仪器和用品：

酶标仪、台式离心机、可调式移液器、96 孔板、研钵、冰、蒸馏水。

试剂的组成和配制：

试剂一：液体 12 mL×1 瓶,4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶, -20℃保存；临用前加入 6 mL 试剂三充分溶解待用，用不完的试剂分装后-20℃保存；

试剂三：液体 10 mL×1 瓶,4℃保存；

试剂四：液体 1.5mL×1 管， 4℃避光保存。

乙醇提取：

1、组织：按照组织质量（g）：蒸馏水体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 蒸馏水），进行匀浆，8000g，25℃离心 10min，取上清待测。

2、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：蒸馏水体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 蒸馏水）， 超声波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）， 8000g，25℃ 离心 10min，取上清待测。

3、血清（浆）等液体样品：直接测定。

测定步骤：

1、酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 450nm。

2、工作液的配制：临用前按照样本数量，按以下比例配制工作液

3、样本测定

按下表在 96 孔板中加入如下试剂

混匀后记录 450nm 下测定初始吸光值 A1，和 37℃避光孵育 10min 后的吸光值 A2，计算△A=A2-A1。

乙醇含量计算：

标准条件下测定回归方程为 y = 0.0256x + 0.0055 R2 = 0.9991； x 为乙醇含量（μmol/mL），y 为吸光值差值△A。

按照血清（浆）体积计算

乙醇含量（μmol/mL）= (△A-0.0055)÷0.0256=39.1×(△A-0.0055)

按照样品质量计算

乙醇含量（μmol/g 鲜重）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷(W ×V1÷V2）

= 39.1×(△A-0.0055)÷W

按照细菌或细胞密度计算

乙醇含量（μmol/104 cell）= [ (△A-0.0055)÷0.0256×V1]÷（500×V1÷V2）

=0.078×(△A-0.0055)

V1：加入反应体系中样本体积，0.04mL；V2：加入提取液体积，1 mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万；

注意事项：

测定前取 1-2 个样做预实验，若△A﹥0.3 或乙醇含量﹥10μmol/mL，需将样本用蒸馏水稀释后再测定，以确保测定的准确性。

最低检测限：0.02μmol/mL。