6-磷酸葡萄糖脱氢酶（G6PDH）试剂盒说明书(分光光度法)

货号：LE-1-337

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

G6PDH（EC 1.1.1.49）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是磷酸戊糖途径的关键酶，催化 6-磷酸葡萄糖氧化为 6 -磷酸葡萄糖酸内酯，同时将 NADP⁺ 还原为 NADPH，供 生物合成及维持细胞内的还原状态用。 因此 6-磷酸葡萄糖脱氢酶活性的高低可以从一定程 度上反映出生物体的生物合成和抗氧化能力。

测定原理：

G6PDH 催化 NADP⁺ 还原生成 NADPH，在 340 nm下测定 NADPH 增加速率。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸 馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体 47.5 mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 1000~5000： 1 的比例（建议 2000 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、将试剂二和试剂三转移至试剂一中充分溶解；在 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种） 水浴 10min 以上； 用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂一，混匀后立即记录 340nm 处 1min 后吸光值 A1 和 6min 后的吸光值 A2 ，计算 ΔA=A2-A1。

注意：若 ΔA 大于 0.5 ，需将酶液用提取液稀释，计算公式中乘以相应稀释倍数。或将反应时间缩短至 2min，使 A2-A1 小于 0.5 ，可提高检测灵敏度。

G6PDH 活力单位的计算：

1、血清（浆）G6PDH 活力的计算:

单位的定义：每 mL 血清（浆）每分钟生成 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 

G6PDH（nmol/min/mL）＝[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷V 样÷T

=643×ΔA

2、组织、细菌或细胞中G6PDH 活力的计算:

（1）按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（nmol/min /mg prot）＝[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

=643×ΔA÷Cpr

（2）按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（nmol/min /g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T

=643×ΔA÷W

（3）按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

G6PDH（nmol/min /10⁴ cell）＝[ΔA×V 反总÷ ( ε×d）×110⁹]÷(2000×V 样÷V 样总) ÷T

=0.3215×ΔA

V 反总：反应体系总体积， 1×10^-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm； d： 比色皿光径， 1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入提取液体积， 1 mL； T： 反应时间，5  min； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；2000：细菌或细胞 总数，2000 万。