货号：LE-1-341

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

ME 广泛存在于微生物、培养细胞、动物和植物胞浆中，尤其在植物组织中活性较高 。ME 催化苹果酸氧化脱羧的可逆反应，产生丙酮酸和 CO₂ ，以及伴随 NAD(P)⁺ 的还原反应，是苹果酸代谢的关键酶。ME 活性与 生物合成和抗氧化密切相关。近年来植物 ME  活性测定较多， 已经成为抗氧化研究的热点。根据辅酶专一性和对底物特异性的不同，可将 ME 分为 NAD-ME(EC1.1.1.38)和 NADP-ME(EC1.1.1.40)。

测定原理：

NADP-ME 催化 NADP⁺ 还原成 NADPH ，在 340nm 下测定 NADPH 增加速率。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿和蒸馏水。

试剂的组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。；

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：粉剂×1瓶 ，-20℃保存；  临用前加入 50mL 试剂一充分振荡，溶解待用，用不完的试剂分装后-20度保存，禁止反复冻融。

试剂三：粉剂×1瓶，-20℃保存；临用前加入 6mL 蒸馏水充分振荡，溶解待用，用不完的试剂分装后-20 度保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

1、细菌、细胞或组织样品的制备：

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液  体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰  浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）； 14000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1 ：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）， 进行冰浴匀浆。 14000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 850μL 试剂二 ，混匀 ，30℃孵育 5min，加入 100μL 试剂三， 混匀后立即记录 340nm 处初始吸光值 A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

NADP-ME 活性计算：

1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（nmo/min/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷  ( ε×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T

= 3215×ΔA÷Cpr

此法需要自行测定样本蛋白质浓度。

2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（nmo/min/g  鲜重）＝[ΔA×V 反总÷  ( ε×d）×10⁹]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T

=3215×ΔA÷W

3、按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol NADPH 定义为一个酶活力单位。

NADP-ME（nmo/min/10⁴ cell）=[ΔA×V 反总÷  ( ε×d）×10⁹]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T

=6.43×ΔA

V 反总：反应体系总体积，1×10^-3 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL；V 样总：加入提取液体积， 1 mL； T：反应时间， 1 min；Cpr：样本蛋白质 浓度，mg/mL；W：样本质量，g； 500：细菌或细胞总数，500 万。