产品名称:转氢酶-1测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:LE-1-304,LE-2-304
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
LE-1-304 |
转氢酶-1测试盒 |
可见分光光度法 |
50管/48样 |
850 |
LE-2-304 |
转氢酶-1测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
1600 |
测定意义
TH位于线粒体的内膜上,又称为呼吸电子传递链复合体六,催化NADH+NADP+和NAD++NADPH 相互转化。催化正向反应称为TH-1。线粒体NADH含量增加时会导致线粒体膜的 H+电化学梯度升高,因而促进了电子传递链上ROS的产生。TH-1促进NADH转换为NADPH,从而提高线粒体的抗氧化能力。
测定原理
NADH和NADPH均在340nm有特征吸收,因此TH催化的转氢反应不能导致340nm吸光度发生变化。用人工合成底物3-乙酰吡啶腺嘌呤二核苷酸磷酸(APADP +)替代NADP +,TH-1催化APADP+还原生成的APADPH在375nm有特征光吸收,因此通过测定375nm光吸收增加速率,来计算TH-1活性。
需自备的仪器和用品
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一:液体 100mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂二:液体 50mL×1 瓶,-20℃保存;
试剂三:液体 18mL×1 瓶,4℃保存;
试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;
试剂五:粉剂×1 支,-20℃保存;
样本的前处理:
组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:
① 准确称取0.1g组织或收集500万细胞,加入1mL试剂一,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。
② 将匀浆600g,4℃离心 5min。
③ 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11100g,4℃离心10min。
④ 上清液即为除去线粒体的胞浆蛋白,可用于测定从线粒体泄漏的TH-1(此步可选做)。
⑤ 步骤④中的沉淀即为线粒体,加入500uL试剂二,超声波破碎,冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10秒,重复30次),用于TH-1活性测定。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热30min以上,调节波长至375nm,蒸馏水调零。
2、样本测定
(1)工作液的配制:临用前将试剂四、五转移到试剂三中混合溶解,置于37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴5min;现配现用;
(2)在微量石英比色皿或96孔板中加入20μL样本和180μL工作液,混匀,立即记录375nm处初始吸光值A1和10min 后的吸光值A2,计算 ΔA=A2-A1。
TH-1 活性计算
a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T
=149×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算
单位的定义:每g组织每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W× V样÷V样总) ÷T=74.5×ΔA÷W
3、按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.149×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10 -4 L;ε:APADPH 摩尔消光系数,6.7×10 3 L/mol/cm;d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b.用96孔板测定的计算公式如下
1、按样本蛋白浓度计算
单位的定义:每mg组织蛋白每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T
=298×ΔA÷Cpr
2、按样本鲜重计算
单位的定义:每 g 组织每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1活性(nmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W×V 样÷V样总) ÷T=149×ΔA÷W
3、按细菌或细胞密度计算
单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟产生1nmol APADPH定义为一个酶活性单位。
TH-1 活性(nmol/min /104cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=0.298×ΔA
V 反总:反应体系总体积,2×10 -4 L;ε:APADPH 摩尔消光系数,6.7×103 L/mol/cm;d:96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.02 mL;V 样总:加入提取液体积,0.5mL;T:反应时间,10 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
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