产品名称:乙酰辅酶A测试盒
产品规格:25管/24样,10管/9样,50管/48样,100管/96样
产品货号:YX-C-B106-50,YX-C-B106-10,YX-C-B106-25,YX-W-B106
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-B106-50 |
乙酰辅酶A测试盒 |
紫外分光光度法 |
50管/48样 |
3200 |
YX-C-B106-25 |
乙酰辅酶A测试盒 |
紫外分光光度法 |
25管/24样 |
2000 |
YX-C-B106-10 |
乙酰辅酶A测试盒 |
紫外分光光度法 |
10管/9样 |
1200 |
YX-W-B106 |
乙酰辅酶A测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
5800 |
乙酰辅酶 A(Acetyl-CoA)含量测定试剂盒说明书(微量法)
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义
乙酰辅酶A广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。是生物体能源物质代谢过程中产生的一种重要的中间代谢产物。在体内能源物质代谢中是一个枢纽性的物质。糖、脂肪、蛋白质三大营养物质通过乙酰辅酶A汇聚成一条共同的代谢通路-三羧酸循环和氧化磷酸化,经过这条通路彻底氧化生成二氧化碳和水,释放能量用于ATP合成。此外,乙酰辅酶A是合成脂肪酸,酮体,胆固醇及其衍生物等生理活性物质的前体物质。
测定原理
苹果酸脱氢酶可催化苹果酸和NAD生成草酰乙酸和NADH。柠檬酸合酶可催化乙酰辅酶A和草酰乙酸生成柠檬酸和辅酶A。利用苹果酸脱氢酶和柠檬酸合酶的偶联反应,乙酰辅酶A含量和NADH的生成速率成正比,340nm下吸光值的上升速率反应了乙酰辅酶A含量的高低。
需自备的仪器和用品
紫外分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、.研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制
试剂一:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:粉剂×1 支,-20℃保存。临用前加入250μL试剂五充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂三:液体×1 支,4℃保存。临用前加入250μL试剂五充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂四:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加入22.5mL试剂五充分溶解备用;用不完的试剂 4℃保存一周;
试剂五:液体 30mL×1 瓶,4℃保存。
工作液的配制: 临用前请根据拟用工作液体积(样本数×0.23 m L),将试剂二、三和四按照 1:1:90 的比例混合,或者直接把试剂二和试剂三加入到试剂四中混匀(可以测定96样);加样前置 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)水浴锅中预热 30 min;现配现用;
乙酰辅酶 A 的提取
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104个):试剂一体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL试剂一),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或200W,超声3s,间隔10s,重复30次);8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):试剂一体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g组织,加入1mL试剂一),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热30min,用蒸馏水于340nm处调零。
2、将工作液置37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)水浴锅中预热10min。
3、取25μL样本和230μL工作液至微量石英比色皿或者96孔板,混匀,立即记录340nm处20s的吸光值A1和80s时的吸光值A2,计算ΔA=A2-A1。
乙酰辅酶 A 含量计算
a.使用微量石英比色皿测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为y=1640x + 0.012;x为吸光值,y为标准品浓度(nmol/mL)。
注意:本试剂盒最低检测限为 1.6nmol/mL。
(1)按照蛋白浓度计算
乙酰辅酶A含量(nmol/mg prot)=[(1640×ΔA+0.012)×V1]÷(V1×Cpr)
=(1640×ΔA+0.012) ÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按照样本质量计算
乙酰辅酶 A 含量(nmol/g 鲜重)=[(1640×ΔA+0.012)×V1]÷(W×V1÷V2)
=(1640×ΔA+0.012)÷W
(3 ) 按照细菌或细胞密度计算:
乙酰辅酶 A 含量(nmol/104)=[(1640×ΔA+0.012)×V1]÷(500×V1÷V2)
=(1640×ΔA+0.012)÷500
V1:加入反应体系中样本体积,0.025mL;V2:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
b.使用96孔板测定的计算公式如下:
标准条件下测定的回归方程为 y=3280x+0.024;x为吸光值,y为标准品浓度(nmol/mL)。
注意:本试剂盒最低检测限为 1.6nmol/mL。
(1)按照蛋白浓度计算
乙酰辅酶A含量(nmol/mg prot)=[(3280×ΔA+0.024) ×V1]÷(V1×Cpr)
=(3280×ΔA+0.024) ÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
(2)按照样本质量计算
乙酰辅酶A含量(nmol/g 鲜重)=[(3280×ΔA+0.024) ×V1]÷(W×V1÷V2)
=(3280×ΔA+0.024)÷W
(3 ) 按照细菌或细胞密度计算:
乙酰辅酶 A含量(nmol/104)=[(3280×ΔA+0.024)×V1]÷(500×V1÷V2)
=(3280×ΔA+0.024)÷500
V1:加入反应体系中样本体积,0.025mL;V2:加入提取液体积,1 mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万
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