丙酮酸脱氢酶（PDH）活性检测试剂盒说明书（可见分光光度法）

注意：正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二：液体 1mL×1 支，-20℃避光保存；

试剂三：液体 50mL×1  瓶，4℃保存；

试剂四：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂五：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂六：粉剂×1 支，4℃保存；

试剂七：粉剂×1 支，4℃保存；

工作液的配制：临用前把试剂四、五、六、七转移到试剂三中混合溶解待用；用不完的试剂4℃ 保存一周。

产品说明：

PDH（EC 4.1.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是丙酮酸脱氢酶复合体(PDHC)催化丙酮酸氧化脱羧的限速酶，催化丙酮酸脱梭生成羟乙基-TPP，把糖酵解和三羧酸循环连接起来。

PDH 催化丙酮酸脱氢，同时还原2,6-二氯酚靛酚（2,6-DCPIP），从而导致605nm 光吸收的减少。

需自备的仪器和用品：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1mL 玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一、样本的处理

称取约 0.1g 组织或收集 500 万细胞，加入 1mL 试剂一和 10µL 试剂二，用冰浴匀浆器或研钵匀浆充分研磨，4 ℃ 11000 g 离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 605nm，蒸馏水调零。

2、每个样本需要900µL 工作液，按样本数加一取出一定量的工作液于37℃（哺乳动物）或25℃（其他物种）中孵育5min。

3、空白管：在1mL 比色皿中加入 900 µL 工作液和50µL 水，混匀，立即记录605nm 处初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值 A2，计算 ∆A 空白=A1-A2。

4、测定管：在 1mL 比色皿中加入 900 µL 工作液和50µL 样本，混匀，立即记录 605nm 处初始吸光值A3 和1min 后的吸光值A4，计算∆A 测定=A3-A4。

三、PDH 活性计算

（1）按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。PDH 活性（U /mg prot）=[(∆A 测定-∆A 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(V 样×Cpr)÷T=904.762×(∆A 测定-∆A 空白)÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。PDH 活性(U/g 鲜重)=[(∆A 测定-∆A 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(W×V 样÷V 样总)÷T=913.81×(∆A 测定-∆A 空白)÷W

（3）按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 2,6-二氯酚靛酚定义为一个酶活性单位。PDH 活性(U/104 cell)=[(∆A 测定-∆A 空白)×V 反总÷(ε×d)×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=1.828×(∆A 测定-∆A 空白)

     V 反总：反应体系总体积，9.5×10-4 L；ε：2,6-二氯吲哚酚摩尔消光系数，2.1×104 L / mol /cm； d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.05 mL；V 样总：加入试剂一和试剂二体积，1.01 mL； T：反应时间，1 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数， 500 万。

注意事项：

1、测定过程中所有样本在冰上放置，以免变性和失活。

2、测定管的∆A 值在 0.01-0.25 之间，若测定管的∆A 值大于 0.25，需将样本进行稀释。

3、由于提取液中含有一定浓度的蛋白（约1mg/mL），所以在测定样品蛋白浓度时需要减去提取液本身的蛋白含量。