乙酸激酶（acetate kinase，ACK）试剂盒说明书（微量法）

测定意义：

ACK 主要存在于微生物中，催化乙酸和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP，是细菌碳代谢和能量代谢的关键酶，尤其是在古细菌甲烷合成代谢中起着中枢作用。

测定原理：

（1）ACK 催化乙酸钠和 ATP 生成乙酰磷酸和 ADP，（2）丙酮酸激酶催化 ADP 和 PEP 生成 ATP 和丙酮酸，（3）乳酸脱氢酶催化丙酮酸和 NADH 生成乳酸和 NAD+，（4）在 340nm 下测定 NADH氧化生成 NAD+速率，即可反映 ACK 活性。

自备实验用品及仪器：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存

试剂一：液体 18mL×1 瓶，4℃保存

试剂二：粉剂×1 瓶，-20℃保存

试剂三：液体 400μ L×1 支，4℃保存

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。15000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、样本测定

（1） 工作液的配置，将试剂二和试剂三转移至试剂一中，充分混合溶解，置于 37℃（哺乳动物）或 25℃（其它物种）水浴 5min；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融；

（2） 在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 20μ L 样本和 180μ L 工作液，混匀，立即记录340nm处 20s 时的吸光值A1 和 3min20s 后的吸光值 A2，计算 Δ A=A1-A2。

ACK 活性计算：
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、按样本蛋白浓度计算：
单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=536×Δ A÷Cpr
2、按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK（nmol/min /g 鲜重）= [Δ A×V反总÷（ε  ×d）×10⁹]÷(W× V样÷V样总) ÷T=536×Δ A÷W
3、按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK （ nmol/min /10⁴ cell ） =[Δ A×V 反总÷ （ ε ×d ） ×10⁹]÷(500×V 样 ÷V 样总)÷T=1.072×Δ A
V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1、按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

ACK（nmol/min /mg prot）=[Δ A×V 反总÷（ε  ×d）×10⁹]÷(V 样×Cpr) ÷T=1072×Δ A÷Cpr

2、按样本鲜重计算：
单位的定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK （ nmol/min /g 鲜重） = [Δ A×V 反总÷ （ ε ×d ） ×10⁹]÷(W ×V 样÷V 样总)÷T=1072×Δ A÷W
3、按细菌或细胞密度计算：
单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
ACK （ nmol/min /10⁴ cell ） =[Δ A×V 反总÷ （ ε ×d ） ×10⁹]÷(500×V 样 ÷V 样总)÷T=2.144×Δ A
V 反总：反应体系总体积，2×10^-4 L；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×10³ L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.02 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，3 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数， 500 万。