锰过氧化物酶（Manganese peroxidase ，Mnp）试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义

锰过氧化物酶（EC1.11.1.13）是一种含亚铁血红素的过氧化物酶，主要存在于担子菌中，属于木质素降解酶系，能有效的降解木质素及废水和土壤中比较难降解的氯化物，叠氮化合物、DTT，多环芳烃等。

测定原理

锰过氧化物酶在Mn²⁺存在的条件下，将愈创木酚氧化为四邻甲氧基连酚，在465nm有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器

天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制

试剂一：液体 110mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 2mL×1 支，4℃保存。

试剂三：液体 4mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：液体 2mL×1 支，4℃保存。

酶液提取

1. 组织：按照质量（g）：试剂一体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g，加入1mL试剂一）加入试剂一，冰浴匀浆后于4℃，10000g 离心10min，取上清置于冰上待测。

2. 细胞：按照细胞数量（10⁴个）：试剂一体积（mL）为500~1000：1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间 3min）；然后 4℃，10000g 离心10min，取上清置于冰上待测。

3. 培养液或其它液体：直接检测。

测定操作

酶活计算公式

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 83×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/g）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 83×△A÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/10⁴cell）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T

= 83×△A÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/L）=△A÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T= 8.3×10⁴×△A

ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，10min

b. 用96孔板测定的计算公式如下

1．按照蛋白浓度计算

酶活性定义：每毫克蛋白每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/mg prot）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 166×△A÷Cpr

2．按照样本质量计算

酶活性定义：每克样品每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/g）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T= 166×△A÷W

3．按照细胞数量计算

酶活性定义：每10⁴个细胞每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/10⁴cell）=△A÷ε÷d×V 反总÷（V 样×细胞数量÷V 样总）÷T

= 166×△A÷细胞数量

4．按照液体体积计算

酶活性定义：每升培养液每分钟氧化1nmol愈创木酚所需的酶量为一个酶活力单位。

MnP 活性（nmol/min/L）=△A÷ε÷d×V 反总÷V 样÷T= 1.66×10⁵×△A

ε：愈创木酚摩尔消光系数：12100L/mol/cm；d：比色皿光径，0.5cm；V 反总：反应总体积，1mL；V 样：反应中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；W：样本质量，g；T：反应时间，10min