产品名称:α-葡萄糖苷酶(α-GC)测试盒
产品规格:50管/24样,100管/48样
产品货号:YX-W-B612,YX-C-B612
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货号
产品名称
检测方法
规格
售价(元)
YX-C-B612
α-葡萄糖苷酶(α - GC)测试盒
可见分光光度法
50管/24样
550
YX-W-B612
α-葡萄糖苷酶(α - GC)测试盒
微量法
100管/48样
1050
α-葡萄糖苷酶( α-GC)活性检测试剂盒说明书(微量法)
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
产品内容:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一:粉剂×1 瓶,-20℃保存; 临用前每瓶加入 12mL 双蒸水,充分溶解备用; 用不完的试 剂仍-20℃保存。
试剂二:液体 15mL×1 瓶,4℃保存。
试剂三:液体 15mL×1 瓶,4℃保存。
标准品:液体×1 支,5μmol/mL 的对硝基苯酚溶液。
产品说明:
α-GC(EC 3.2.1.20)广泛存在于动物、 植物、微生物和培养细胞中,催化水解芳基或烃基与糖基 之间的α-糖苷键生成葡萄糖,不仅与细胞壁的松弛或加固有关,而且与细胞识别和一些信号分子产 生密切相关。
α-GC 分解对-硝基苯-α-D 吡喃葡萄糖苷生成对-硝基苯酚,后者在 400nm 有最大吸收峰,通过 测定吸光值升高速率来计算α-GC 活性。
自备用品:
可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研 钵、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、粗酶液提取:
1 、细菌或培养细胞的处理: 收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清; 按照每 1000 万细菌或细 胞加入1mL 提取液,超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3 秒, 间隔 10 秒, 重复 30 次), 15000g ,4℃,离心 20min ,取上清,置冰上待测。
2 、组织的处理:称取约 0.2g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆;15000g,4℃,离心20min ,取上清,置冰上待测。
3 、标准样品的准备:取 100μL 标准液,加入到 400μL 试剂三中,得到 1μmol/mL 标准液,十倍稀 释到 100nmol/mL ,用蒸馏水倍比稀释: 50 、25 、12.5 、6.25 、0 nmol/mL 。100 、50 、25 、12.5、 6.25 、0 nmol/mL 做标准液。
二、测定步骤
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 400nm ,蒸馏水调零。
2、加样表
试剂名称(μL) |
测定管 |
对照管 |
标准管 |
试剂一 |
100 |
|
|
试剂二 |
150 |
150 |
|
样本 |
30 |
30 |
|
充分混匀,放入 37℃准确水浴 30min 后,立即放入沸水浴中煮沸 5min(盖紧,以防止水分散失), 流水冷却后充分混匀(以保证浓度不变)
试剂一 |
|
100 |
|
充分混匀,8000g ,4℃ ,离心 5min ,取上清液(在 EP 管或 96 孔板中加入下列试剂)
上清液 |
70 |
70 |
|
标准液 |
|
|
70 |
试剂三 |
130 |
130 |
130 |
充分混匀,室温静置 2min 后, 400nm 处测定吸光值 A ,计算ΔA=A 测定管-A 对照管。
三、α-GC 活力计算:
1 、标准曲线建立: 根据标准管的浓度(y)和吸光度(x ,各标准管减去浓度为 0 的标准管为标准 管 A)),建立标准曲线。
2 、根据标准曲线,将ΔA(x )带入公式计算样品产物浓度(nmol/mL)。
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义: 每 mg 组织蛋白在每mL 体系中每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
GC 活力(U/mg prot)=(y×V 反总)÷(V 样×Cpr)÷T=18.67×y÷Cpr
需要另外测定,建议使用本公司 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
(2) 按样本鲜重计算:
单位的定义: 每 g 组织在每 mL 体系中每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力单位。
GC 活力(U/g 鲜重) = (y×V 反总)÷(W×V 样÷V 样总)÷T=18.67×y÷W
(3) 按细菌或细胞数量计算:
单位的定义: 每 1 万个细菌或细胞在每 mL 体系中每小时产生 1nmol 对-硝基苯酚定义为一个酶活力 单位。
GC 活力(U/104 cell)=(y×V 反总)÷(1000×V 样÷V 样总)÷T=0.0187×y
Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;V 反总: 反应体系总体积,0.28mL;V 样: 加入反应体系中样本 体积,0.03mL;V 样总: 加入提取液体积,1mL;W:样品质量,g;1000:细胞或细菌总数,1000 万; T:反应时间,0.5h。
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