产品名称:滤纸酶测试盒(活性)
产品规格:50管/24样,100管/48样
产品货号:YX-C-B623,YX-W-B623
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-B623 |
滤纸酶测试盒(活性) |
可见分光光度法 |
50管/24样 |
600 |
YX-W-B623 |
滤纸酶测试盒(活性) |
微量法 |
100管/48样 |
1180 |
测定原理
滤纸酶水解滤纸产生的还原糖能与3,5-二硝基水杨酸生成红棕色氨基化合物,在540nm 处有最大光吸收,在一定范围内反应液颜色深浅与还原糖的量成正比,可测定计算得滤纸酶的
活力。
自备实验用品及仪器
天平、研钵、低温离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。
试剂组成和配制
试剂一:液体 25mL×1 瓶,4℃保存。
试剂二:液体 40mL×1 瓶,4℃保存。
滤纸条:50mg×50 条。
酶液提取
1. 组织:按照质量(g):蒸馏水体积(mL)为1:5~10的比例(建议称取约0.1g,加入1mL蒸馏水)加入蒸馏水,冰浴匀浆后于4℃,12000rpm 离心10min,取上清置于冰上待测。
2. 细胞:按照细胞数量(104个):蒸馏水体积(mL)为500~1000:1的比例(建议500万细胞加入1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率300w,超声3秒,间隔7秒,总时间3min);然后 4℃,12000rpm 离心10min,取上清置于冰上待测。
3. 培养液或其它液体:直接检测。
测定操作
1. 根据样本数量取两倍数量的滤纸条和Ep管,每支Ep管中放入一个卷状滤纸条(注意要放入底部),作为底物。
2. 对照管:取200μL灭活的酶液,加入500μL试剂一,充分混匀,再加入放有滤纸条的Ep管中,标注为对照管。
3. 测定管:取200μL酶液,加入500μL试剂一,充分混匀,再加入放有滤纸条的Ep管中,标注为测定管。
4. 对照管和测定管同时置于50℃水浴锅中反应30min。
5. 加入800μL试剂二,沸水浴5min,自来水冷却后取200μL于微量石英比色皿/96孔板中测定540nm处吸光值,分别记为A对照管和A测定管,△A= A测定管- A对照管。
酶活性计算公式
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.2805x-0.0255,R2=0.9991
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在 50℃,pH4.6条件下,每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的
酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷0.2805×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T
= 0.891×(△A+0.0255)÷ Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义:在50℃,pH4.6条件下,每克组织每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/g)=(△A+0.0255)÷0.2805×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 0.891×(△A+0.0255)÷ W
(3)按液体体积计算
酶活性定义:在 50℃,pH4.6条件下,每毫升培养液每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需
的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷ 0.2805×V 反总÷V 样÷T
= 0.891×(△A+0.0255)
(4)按细胞数量计算
酶活性定义:在 50℃,pH4.6条件下,每104个细胞每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需
的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/104cell)=(△A+0.0255)÷0.2805×V 反总÷(V 样×细胞数量(万个)÷V 样总)÷T= 0.891×(△A+0.0255)÷ 细胞数量(万个)
V 反总:反应总体积,1.5mL,V 样:反应体系中加入样本体积,0.2mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线:y=0.1403x-0.0255,R2=0.9991
(1)按照蛋白浓度计算
酶活性定义:在 50℃,pH4.6条件下,每毫克蛋白每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/mg prot)=(△A+0.0255)÷0.1403×V 反总÷(V 样×Cpr)÷T
=1.782×(△A+0.0255)÷ Cpr
(2)按照样本质量计算
酶活性定义:在50℃,pH4.6条件下,每克组织每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/g)=(△A+0.0255)÷0.1403×V 反总÷(W×V 样÷V 样总)÷T
= 1.782×(△A+0.0255)÷ W
(3)按液体体积计算
酶活性定义:在 50℃,pH4.6条件下,每毫升培养液每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/mL)=(△A+0.0255)÷0.1403×V 反总÷V 样÷T
= 1.782×(△A+0.0255)
(4)按细胞数量计算
酶活性定义:在 50℃,pH4.6条件下,每104个细胞每分钟分解滤纸产生1mg葡萄糖所需的酶量为一个酶活力单位。
FPA(U/104cell)=(△A+0.0255)÷0.1403×V反总÷(V样×细胞数量(万个)÷V样总)÷T= 1.782×(△A+0.0255)÷ 细胞数量(万个)
V 反总:反应总体积,1.5mL,V 样:反应体系中加入样本体积,0.2mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;Cpr:样本蛋白浓度,mg/mL;W:样本质量,g;T:反应时间,30min
注意事项
1. 用干净的镊子取出滤纸条,带手套卷成卷放入 Ep 管底部。
2. 样本灭活时保证同一批样本处理时间一致,建议沸水浴十分钟。
3. 批量样本测定之前先做 1-2 个样本的预实验,若吸光值超过 1.2,建议将样本用蒸馏水稀释后再进行测定,计算公式中乘以稀释倍数。
4. 显色后取检测液时注意枪头不要碰到滤纸条,以免带入毛状物,影响测定结果。
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