产品内容：

试剂一：液体×1瓶，－20℃保存。用前1 d取出置于4℃充分解冻后混匀。

试剂二：粉剂×1瓶。临用前加入440 μL试剂四，充分溶解。

试剂三：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入440 μL试剂四，充分溶解。

试剂四：液体×1瓶，4℃保存。

试剂五：粉剂×1瓶，4℃保存。临用前加入840μL试剂四，充分溶解。

产品简介：

FAS是脂肪酸合成关键酶，催化乙酰辅酶A和丙二酰辅酶A而生成长链脂肪酸。FAS普遍表达于各种组织细胞中，在哺乳动物肝、肾、脑、肺和乳腺以及脂肪组织中表达丰富。

FAS催化乙酰CoA、丙二酰CoA和NADPH生成长链脂肪酸和NADP⁺；NADPH在340nm有吸收峰，而NADP⁺没有；通过测定340nm 光吸收下降速率，计算FAS活性。

试验中所需的仪器和试剂：

研钵、冰、台式离心机、紫外分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96孔板、可调式移液枪和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

1. 组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（mL）为1:5-10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL试剂一）进行冰浴匀浆。16000rpm，4℃离心40min，取上清置于冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（10⁴个）：提取液体积（mL）为500-1000:1的比例（建议500万细胞加入1mL试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率300w，超声3秒，间隔7秒，总时间3分钟）；然后16000rpm，4℃离心40min，取上清置于冰上待测。

二、FAS测定操作：

1. 分光光度计预热30min，调节波长到340 nm，蒸馏水调零。

2. 试剂四置于40℃水浴中预热30 min以上。

3. 空白管：在500μLEP管中依次加入20μL蒸馏水、4μL试剂二、4μL试剂三、164μL试剂四和8μL试剂五，迅速混匀后于340nm处测定吸光值，记录第30s和90s时吸光值，分别记录为A1和A2。△A空=A1-A2。

4. 测定管：在500μLEP管中依次加入20μL上清液、4μL试剂二、4μL试剂三、164μL试剂四和8μL试剂五，迅速混匀后于340nm处测定吸光值，记录第30s和90s时吸光值，分别记录为A1和A2。△A测=A3-A4。

三、FAS 活性计算：

使用微量石英比色皿测定的计算公式如下：

（1） 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/mg prot) =[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(Cpr×V样)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/g) =[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(W×V样÷V样总)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷W

（3） 按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/10⁴ cell ) =[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=1.61×(△A测定管–△A空白管) ÷细胞数量

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光径，1 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；T：反应时间，1min。

使用96孔板测定的计算公式如下：

（1） 按照蛋白浓度计算

活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/mg prot) =[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(Cpr×V样)÷T=3.22×(△A测定管–△A空白管) ÷Cpr

（2） 按照样本质量计算

活性单位定义：37℃中每克组织每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/g) =[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(W×V样÷V样总)÷T=3.22×(△A测定管–△A空白管) ÷W

（3） 按细胞数量计算

活性单位定义：37℃中每10⁴个细胞每分钟氧化1μmol NADPH 为1U。

FAS(U/10⁴ cell ) =[(△A测定管–△A空白管)÷ε÷d×V反总×10⁶] ÷(细胞数量×V样÷V样总)÷T=3.22×(△A测定管–△A空白管) ÷细胞数量

ε：NADPH摩尔消光系数，6.22×10³L/mol/cm；d：96孔板光径，0.5 cm；V反总：反应体系总体积，200μL=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，V样：加入反应体系中上清液体积，20μL=0.02mL；T：反应时间，1min。

注意事项：上清液蛋白质浓度需要另外测定，建议使用本公司BCA蛋白质含量测定试剂盒。