酰基转移酶（alcohol acyl transferase ，AAT） 活性测定试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

AAT 是一个多功能蛋白大家族，主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应，在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理：

AAT 催化乙酰 CoA 转移乙酰基到丁醇，释放的CoA 还原 DTNB 生成 TNB；TNB 在 412nm 有吸收峰，测定 412nm 吸光度增加速率可计算 AAT 活性。

自备实验用品及仪器：

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 100 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存。

试剂三：粉剂×1 管，-20℃保存。临用前加蒸馏水 1mL 充分溶解，4℃保存。

试剂四：液体 2 mL×1 管，4℃保存。

试剂五：粉剂×1 管，4℃避光保存。临用前加入试剂二 1mL 充分溶解，4℃避光保存。

粗酶液提取：

1.组织：按照组织质量（g）：试剂一体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 试剂一）进行冰浴匀浆。12000g，4℃离心 20min，取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：试剂一体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 1mL 试剂一），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 12000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

3.液体：直接检测。

AAT 测定操作：

1.分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 412nm，蒸馏水调零。

2.试剂二在 37℃水浴保温 30min 以上。

3.空白管：依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20µL 蒸馏水、140µL 预热的试剂二、10µL 试剂三、20µL 试剂四和 10µL 试剂五，迅速混匀后于 412nm 比色，记录 10 s 和 130 s 的吸光值，分别记为 A1 和 A2。△A 空=A2-A1。空白管只需做 1 个。

4. 测定管：依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20µL 上清液、140µL 预热的试剂二、10µL 试剂三、20µL 试剂四和 10µL 试剂五，迅速混匀后于 412nm 比色，记录 10 s 和 130 s 的吸光值，分别记为 A3 和 A4。△A 测=A4-A3。如果△A 测偏低，可以延长反应时间，如测定 10 s 和 310 s 的吸光度，相应修改计算公式中反应时间。

AAT 活性计算：
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

（1） 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为 1U。AAT (U/mg prot) = 1000×（△A 测—△A 空）÷(Cpr×V 样) ÷T
= 5000×（△A 测—△A 空）÷Cpr
（2） 按照样本质量计算
活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为 1U。AAT (U/g) = 1000×（△A 测—△A 空）÷(W×V 样÷V 样总) ÷T
= 5000×（△A 测—△A 空）÷W
（3） 按细胞数量计算
活性单位定义：37℃中每 104 个细胞每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为 1U。 AAT (U/104 cell) = 1000×（△A 测—△A 空）÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T
= 5000×（△A 测—△A 空）÷ 细胞数量
Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积， 0.1mL；W：样本质量，g：V 样：加入反应体系中上清液体积，0.1mL；V 样总：提取液体积，
1mL；T：反应时间，2 min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
（1） 按照蛋白浓度计算
活性单位定义：37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为 1U。AAT (U/mg prot) = 1000×(△A 测—△A 空)×V 总÷(Cpr×V 样) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷Cpr
（2） 按照样本质量计算
活性单位定义：37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为 1U。AAT (U/g ) = 1000×(△A 测—△A 空)×V 总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷W
（3） 按细胞数量计算
活性单位定义：37℃中每 104 个细胞每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为 1U。AAT (U/104 cell) = 1000×(△A 测—△A 空)÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷ 细胞数量
Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积， 0.02mL；V 总：反应总体积，0.2 mL；W：样品质量，g；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，15min。Cpr：上清液蛋白浓度，mg/mL，蛋白质浓度需要另外测定；V 样：加入反应体系中上清液体积，0.02mL；V 总：反应总体积，0.2 mL；W：样品质量，g；V 样总：提取液体积，1 mL；T：反应时间，2min。
注意事项：
1. 上清液蛋白质含量需要另外测定。建议购买本公司生产的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
2. 配制好后未使用完的试剂 4℃保存，3 天内使用完毕。