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地址:合肥市包河经济开发区花园大道17号

产品名称:酰基转移酶(AAT)测试盒

产品规格:10管/9样,25管/24样,50管/48样,100管/96样

产品货号:YX-C-B405-10,YX-C-B405-25,YX-C-B405-50,YX-C-B405

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

YX-C-B405-10

酰基转移酶(AAT)测试盒

可见分光光度法

10/9

1200

YX-C-B405-25

酰基转移酶(AAT)测试盒

可见分光光度法

25/24

2000

YX-C-B405-50

酰基转移酶(AAT)测试盒

可见分光光度法

50/48

3000

YX-C-B405

酰基转移酶(AAT)测试盒

微量法

100/96

6000

酰基转移酶(alcohol acyl transferase ,AAT) 活性测定试剂盒说明书(微量法

注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

测定意义:

AAT 是一个多功能蛋白大家族,主要负责催化生物体内各种酰基化和去酰基化反应,在基因表达、代谢和信号传导中具有重要作用。

测定原理:

AAT 催化乙酰 CoA 转移乙酰基到丁醇,释放的CoA 还原 DTNB 生成 TNB;TNB  412nm 有吸收峰,测定 412nm 吸光度增加速率可计算 AAT 活性。

自备实验用品及仪器:

研钵、冰、台式离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、恒温水浴锅。

试剂组成和配制:

试剂一:液体 100 mL×1 瓶,4℃保存。

试剂二:液体 15 mL×1 瓶,4℃保存。

试剂三:粉剂×1 管,-20℃保存。临用前加蒸馏水 1mL 充分溶解,4℃保存。

试剂四:液体 2 mL×1 管,4℃保存。

试剂五:粉剂×1 管,4℃避光保存。临用前加入试剂二 1mL 充分溶解,4℃避光保存。

粗酶液提取:

1.组织:按照组织质量g):试剂一体积(mL) 1:5~10 的比例建议称取约 0.1g 组织,加 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。12000g,4℃离心 20min,取上清置冰上待测。

2.细菌、真菌:按照细胞数量(104 个):试剂一体积mL) 500~1000:1 的比例建议 500万细胞加入 1mL 试剂一),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声秒,间隔秒,总时间 3min);然后 12000g,4℃,离心 20min,取上清置于冰上待测。

3.液体:直接检测。

AAT 测定操作:

1.分光光度计/酶标仪预热 30min,调节波长到 412nm,蒸馏水调零。

2.试剂二在 37℃水浴保温 30min 以上。

3.空白管:依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20µL 蒸馏水、140µL 预热的试剂二、10µL 试剂三、20µL 试剂四和 10µL 试剂五,迅速混匀后于 412nm 比色,记录 10 s  130 s 的吸光值,分别记为 A1 和 A2。△A 空=A2-A1。空白管只需做 1 个。

4. 测定管:依次在 1mL 玻璃比色皿中依次加入 20µL 上清液、140µL 预热的试剂二、10µL 试剂三、20µL 试剂四和 10µL 试剂五,迅速混匀后于 412nm 比色,记录 10 s  130 s 的吸光值,分别记为 A3 和 A4。△A 测=A4-A3。如果△A 测偏低,可以延长反应时间,如测定 10 s 和 310 s 的吸光度,相应修改计算公式中反应时间。

AAT 活性计算:
a. 使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为 1U。AAT (U/mg prot) = 1000×(△A 测—△A 空)÷(Cpr×V 样) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
活性单位定义:37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为 1U。AAT (U/g) = 1000×(△A 测—△A 空)÷(W×V 样÷V 样总) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷W
(3) 按细胞数量计算
活性单位定义:37℃中每 104 个细胞每分钟催化吸光值变化 0.001 个单为 1U。 AAT (U/104 cell) = 1000×(△A 测—△A 空)÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷ 细胞数量
Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定;V 样:加入反应体系中上清液体积, 0.1mL;W:样本质量,g:V 样:加入反应体系中上清液体积,0.1mL;V 样总:提取液体积,
1mL;T:反应时间,2 min。
b.使用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按照蛋白浓度计算
活性单位定义:37℃中每毫克蛋白每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为 1U。AAT (U/mg prot) = 1000×(△A 测—△A 空)×V 总÷(Cpr×V 样) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷Cpr
(2) 按照样本质量计算
活性单位定义:37℃中每克组织每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为 1U。AAT (U/g ) = 1000×(△A 测—△A 空)×V 总÷(V 样÷V 样总×W) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷W
(3) 按细胞数量计算
活性单位定义:37℃中每 104 个细胞每分钟催化吸光值变化 0.001 个单位为 1U。AAT (U/104 cell) = 1000×(△A 测—△A 空)÷(细胞数量×V 样÷V 样总) ÷T
= 5000×(△A 测—△A 空)÷ 细胞数量
Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定;V 样:加入反应体系中上清液体积, 0.02mL;V 总:反应总体积,0.2 mL;W:样品质量,g;V 样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间,15min。Cpr:上清液蛋白浓度,mg/mL,蛋白质浓度需要另外测定;V 样:加入反应体系中上清液体积,0.02mL;V 总:反应总体积,0.2 mL;W:样品质量,g;V 样总:提取液体积,1 mL;T:反应时间,2min。
注意事项:
1. 上清液蛋白质含量需要另外测定。建议购买本公司生产的 BCA 蛋白质含量测定试剂盒。
2. 配制好后未使用完的试剂 4℃保存,3 天内使用完毕。

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