产品名称:α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:YX-C-B100,YX-W-B100
免费咨询:0551-66107970
货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-B100 |
α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)测试盒 |
紫外分光光度法 |
50管/48样 |
720 |
YX-W-B100 |
α酮戊二酸脱氢酶(α-KGDH)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
1400 |
注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
产品内容:
试剂一:液体 60mL×1 瓶 ,4℃保存;
试剂二:液体 0.6mL×1 支,-20℃保存;
试剂三:液体 55mL×1 瓶 ,4℃保存;
试剂四:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂五:粉剂×1 支,4℃保存;
试剂六:粉剂×1 支,-20℃保存;
试剂七:粉剂×1 支,-20℃保存;
试剂八:粉剂×1 支,-20℃避光保存。临用前加入 2mL 双蒸水充分混匀待用,用不完的试剂仍 -20℃保存。
工作液的配制:临用前把试剂四、试剂五、试剂六、试剂七转移到试剂三中混合溶解待用。
产品说明:
α-KGDH (EC 1.2.4.2)广泛存在于动物、植物微生物和培养细胞的线粒体中,是三羧酸循环调 控关键酶之一,催化α-酮戊二酸氧化脱羧生成琥珀酰辅酶 A。
α-KGDH 催化α-酮戊二酸、NAD+ 和辅酶 A 生成琥珀酰辅酶A 、二氧化碳和 NADH ,NADH 在340 nm 有特征吸收峰,以 NADH 的生成速率表示α-KGDH 活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、 可调式移液器、 1mL 石英比色皿、 研钵、 冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、α-KGDH 的提取
称取约 0. 1g 组织或收集约 500 万细胞, 加入 1mL 试剂一和 10uL 试剂二,冰浴用匀浆器或研钵 充分研磨,4 ℃ 11000 g 离心 10min ,取上清,置冰上待测。
二、测定步骤
1. 分光光度计预热 30min 以上,调节波长到 340 nm ,蒸馏水调零
2. 空白管:
取 1mL 工作液加入 1mL 石英比色皿,37℃孵育 5min 后取出比色皿,再依次加入 40μL 试剂八 和 60μL 蒸馏水,混匀并立即测量 340nm 处 0s 的吸光值 A1 ,37℃准确反应 2min ,记录 340nm 处 2min 时的吸光值 A2 ,计算ΔA 空白=A2-A1。
3. 测定管:
取1mL工作液加入1mL石英比色皿,在37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)孵育5min后取出比色皿,再依次加入40μL试剂八和60μL样本,混匀并立即测量340nm处0s的吸光值A3,37℃(哺乳动物)或25℃(其它物种)中准确反应2min,记录340nm处2min时的吸光值A4,计算ΔA 测定=A4-A3。
三、α-KGDH 活性计算
(1) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义: 每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH 活性(U/mg prot)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷(ε×d)×V 反总×109]÷(Cpr×V 样) ÷T =1473.7×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
单位的定义: 每 g 组织在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。
α-KGDH (U/g 鲜重) =[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷ ( ε×d)×V 反总×109]÷(V 样÷V 样总×W)÷T
=1488.5×(ΔA 测定-ΔA 空白)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
单位的定义: 每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟生成 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单 位。
α-KGDH 活性(U/104cell)=[(ΔA 测定-ΔA 空白)÷ ( ε×d)×V 反总×109]÷(V 样÷V 样总×500) ÷T
=2.977×(ΔA 测定-ΔA 空白)
V 反总: 反应体系总体积,1. 1×10-3 L;ε :NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm;d:比色 皿光径,1cm ;V 样: 加入样本体积,0.06mL;V 样总: 加入试剂一和试剂二体积,1.01mL;T: 反应时间,2min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
注意事项:
1 、测定过程中所有试剂和样本在冰上放置,以免变性和失活。
2 、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃ ,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水, 将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。
3 、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。
4 、测定管的ΔA 值在 0.01-0.25 之间,若测定管的ΔA 值大于 0.25 ,需将样本进行稀释。
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