注意：正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。

产品内容 ：

提取液：液体100mL×1  瓶，4℃保存；

试剂一：液体5mL×1  瓶，4℃保存；

试剂二：液体25mL×1  瓶，4℃保存。

丙酮酸钠标准液，1mg/mL：液体1mL×1瓶，4℃保存

产品说明 ：

丙酮酸通过乙酰CoA  连接葡萄糖、脂肪酸和氨基酸三大代谢，起着重要的枢纽作用。 丙酮酸与2,4-二硝基苯肼作用，生成丙酮酸-2,4-二硝基苯腙，在碱性溶液中呈樱红色。

需自备的仪器和用品 ：

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵、冰、 蒸馏水。

操作步骤 ：

一、丙酮酸提取：

1 、细菌或培养细胞： 先收集细菌或细胞到离心管内， 离心后弃上清； 按照细菌或细胞数量（104  个）： 提 取液体积（mL）为500~ 1000：1  的比例（建议500  万细菌或细胞加入1mL  提取液） ，超声波破 碎（冰浴，功率20％或200W ，超声3s ，间隔10s ，重复30  次） ，静置30min ，8000g ，常温离心 10min ，取上清待测。

2 、组织： 按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0. 1g 组织，加入1mL 提取液） ，进行冰浴匀浆，静置30min ，8000g ，常温离心10min ，取上清待测。

3 、血清（浆）样品：按照血清（浆）体积（mL）:提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议取0. 1mL血清（浆）加入1mL提取液，进行冰浴匀浆，静置30min ，8000g ，常温离心10min ，取上清待测。

4 、标准品的准备： 将标准品用蒸馏水稀释至100 、50 、25 、12.5 、6.25 、3. 125 、1.5625 、0g/mL。

二、测定步骤：

1 、分光光度计/酶标仪预热30min  以上，调节波长至520nm ，蒸馏水调零。

2 、在微量玻璃比色皿或 96 孔板中加入 75L 标准液或样本和 25L 试剂一，混匀，静置 2min ，加 入 125L 试剂二，混匀，于 520nm 波长处测定吸光值 A。

三、丙酮酸含量计算：

1 、根据标准品浓度和测定值建立标准曲线； y为丙酮酸钠含量（μg/mL），x为吸光值。

2 、按照血清（浆） 体积计算

丙酮酸含量（ μg/mL）= (y×V1)÷ （V3×V1÷V2）=y×10

3 、按照蛋白浓度计算

丙酮酸含量（ μg/mg prot）=(y×V1)÷(V1×Cpr)=y ÷Cpr

4 、按照样品质量计算

丙酮酸含量（ μg/g  鲜重） = (y×V1)÷(W ×V1÷V2）=y÷W

5 、按照细菌或细胞密度计算

丙酮酸含量（ μg/104 cell）＝(y×V1)÷ （500×V1÷V2）= y÷500

V1：加入反应体系中样本体积，0.075mL；V2：加入提取液体积，1 mL；V3：加入血清（浆） 体积，0.1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。