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产品名称:磷酸果糖激酶(PFK)/6-磷酸果糖激酶/果糖-6-磷酸激酶测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:YX-C-B202,YX-W-B202

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

YX-C-B202

磷酸果糖激酶(PFK)测试盒

紫外分光光度法

50管/48

680

YX-W-B202

磷酸果糖激酶(PFK)测试盒

微量法

100管/96

1300

磷酸果糖激酶(PFK)活性检测试剂盒说明书紫外分光光度法                                                   

注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。

产品内容:

提取液:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;

试剂一:液体 40mL×1 瓶,4℃保存;

试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存,临用前加入 2.8mL 双蒸水充分溶解备用; 

试剂三:液体×1 支,-20℃保存,临用前加入 260µL 双蒸水充分溶解备用; 试剂四:液体×1 支,4℃保存,临用前加入 260µL 双蒸水充分溶解备用;

PFK 工作液(可测 25 个样) 的配制:取 19mL 试剂一和 1.26mL 试剂二充分混匀。

产品说明:

PFK(EC 2.7. 1. 11)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,负责将果糖-6-磷酸和 ATP 转化为果糖- 1,6 二磷酸和 ADP ,是糖酵解过程的关键调节酶之一。

PFK 催化果糖-6-磷酸和 ATP 生成果糖- 1,6-二磷酸和 ADP ,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依 次催化 NADH 氧化生成 NAD+ ,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PFK 活性。

需自备的仪器和用品:

紫外分光光度计、 水浴锅、 台式离心机、 可调式移液器、 1 mL 石英比色皿、 研钵、 冰和蒸馏水。

操作步骤:

一、样本的前处理

1 、细菌、细胞或组织样品的制备

细菌或细胞处理: 收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清; 按照每 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液, 超声波破碎细菌或细胞(功率 20%,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次) ;8000g 4℃离心 10min , 取上清,置冰上待测。

组织处理: 称取约 0. 1g 组织,加入 1mL 提取液进行冰浴匀浆; 8000g 4℃离心 10min ,取上清,置 冰上待测。

2 、血清(浆) 样品: 直接检测。

二、测定步骤

1.分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 340nm ,蒸馏水调零。

试剂名称(µL

测定管

PFK 工作液

800

样本

30

试剂三

5

试剂四

5

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中,加样本的同时开始计时; 在 340 nm 波长下记录 20 秒 时的初始吸光度 A1 ,比色后迅速将比色皿连同反应液一起放入 37℃(哺乳动物) 或 25℃(其它物 种) 水浴中,准确反应 10 分钟; 迅速取出比色皿并擦干,340 nm 下比色,记录 10 分 20 秒时的吸 光度 A2 ,计算∆A=A1-A2。

注意事项

1 、测定过程中试剂三、试剂四和样本在冰上放置,以免变性和失活。

2 、比色皿中反应液的温度必须保持 37℃或 25℃ ,取小烧杯一只装入一定量的 37℃或 25℃蒸馏水, 将此烧杯放入 37℃或 25℃水浴锅中。在反应过程中把比色皿连同反应液放在此烧杯中。

3 、最好两个人同时做此实验,一个人比色,一个人计时,以保证实验结果的准确性。

、若∆A 大于 0.5 ,需将酶液用酶提取液稀释,使∆A 小于 0.5 ,可提高检测灵敏度。

三、PFK 活力单位的计算:

1 、血清(浆) PFK 活力的计算:

单位的定义: 每毫升血清(浆)在反应体系中每分钟催化1nmol 果糖-6-磷酸和1nmolATP 转化为1nmol 果糖- 1,6- 二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。PFKU/mL=[A×V 反总÷  ε×d×109] ÷V ÷T=450×A

2 、组织、细菌或细胞中 PFK 活力的计算:

1)  按样本蛋白浓度计算:

单位的定义: 每 mg 组织蛋白在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖- 1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFKU/mg prot)=[A×V 反总÷  ε×d×109] ÷(Cpr×V )÷T=450×÷Cpr

2)  按样本鲜重计算

单位的定义: 每 g 组织在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖 - 1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFKU/g  鲜重 [A×V 反总÷  ε×d×109] ÷(W×V ÷V 样总)÷T=450×÷W

3)  按细菌或细胞密度计算

单位的定义: 每 1 万个细菌或细胞在反应体系中每分钟催化 1nmol 果糖-6-磷酸和 1nmolATP 转化为 1nmol 果糖- 1,6-二磷酸和 1nmol ADP 定义为一个酶活力单位。

PFKU/104 cell)=[A×V 反总÷ε×d×109] ÷(500×V ÷V 样总)÷T=0.9×A

V 反总: 反应体系总体积,8.4×10-4L;ε :NADH 摩尔消光系数,6.22×103L/mol/cm ;d: 比色皿光 径,1 cm;V 样: 加入样本体积,0.03mL;V 样总: 加入提取液体积,1mL;T:反应时间,10min; Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万; 109 :单位换算 系数,1mol=109nmol。


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