正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

PK（EC 2.7.1.40）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，催化糖酵解过程中的最后一步反应，是糖酵解过程中的主要限速酶之一，也是产生 ATP 的关键酶之一，因此测定PK 活性具有重要意义。

测定原理：

PK 催化磷酸烯醇式丙酮酸和 ADP 生成 ATP 和丙酮酸，乳酸脱氢酶进一步催化 NADH 和丙酮酸生成乳酸和 NAD+，在 340nm 下测定 NADH 下降速率，即可反映 PK 活性。

自备实验用品及仪器：

紫外分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水

试剂的组成和配制：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存; 

试剂一：液体 45mL×1 瓶，4℃保存； 

试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；临用前加入 1.5mL 蒸馏水充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

试剂四：液体 45μ L×1 支，4℃保存；临用前加入 900μ L 蒸馏充分溶解备用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

样本的前处理：

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

测定步骤：

1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：临用前将试剂二转移至试剂一中，充分溶解待用；用不完的试剂分装后-20℃保存，禁止反复冻融。

3、将工作液、试剂三和试剂四 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 10 分钟。

4、加样表：

将上述试剂按顺序加入 1 mL 石英比色皿中，立即混匀，加样本的同时开始计时，在 340nm 波长下记录 20 秒时的初始吸光度A1 和 2 分 20 秒时的吸光度 A2，计算 Δ A=A1-A2。

PK 活性计算：

1、血清（浆）中 PK 活力的计算:

单位的定义：每毫升血清（浆）每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。PK（nmol/min/mL）＝[Δ A×V 反总÷（ε ×d）×109]÷V 样÷T=2613×Δ A

2、组织、细菌或细胞中 PK 活力的计算:

按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /mg prot）＝[Δ A×V 反总÷（ε  ×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=2613×Δ A÷Cpr

按样本鲜重计算：

单位的定义：每g 组织每分钟消耗 1 nmol 的NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（nmol/min /g 鲜重）＝[Δ A×V反总÷（ε  ×d）×109]÷(W× V样÷V样总)÷T=2613×Δ A÷W

按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADH 定义为一个酶活力单位。

PK（ nmol/min /104 cell ）＝ [Δ A×V 反总 ÷ （ ε ×d ） ×109]÷(500×V 样 ÷V 样总)÷T=5.226×Δ A

V 反总：反应体系总体积，9.75×10-4 L；ε ：NADH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm； d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.03 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，2min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数， 500 万。