土壤亚硝酸还原酶（Solid-Nitrite reductase ，S-NiR） 试剂盒说明书（可见分光光度法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

产品内容：

试剂一：液体30mL×1  瓶，-20℃保存。

试剂二：粉剂5mL×1  瓶，-20℃保存（临用前加入5ml蒸馏水） 。

试剂三：液体5mL×1  瓶，4℃保存。

试剂四：粉剂10mL×1  瓶，-20℃保存（临用前加入10ml蒸馏水） 

试剂五：液体25mL×1  瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60 度水浴溶解后使用） 。

试剂六：液体25mL×1  瓶，4℃保存。

标准品：液体1mL×1支，10μmol/mL  亚硝酸钠； -20℃保存。

标准液的配制：用时蒸馏水将标准品稀释0.8 、0.6 、0.4 、0.2 、0. 1μmol/mL。

产品说明：

S-NR 催化土壤中硝酸盐还原为亚硝酸盐，是土壤硝态氮还原的关键酶。研究S-NR 的活性 对合理施肥，降低氮素的损失具有重要意义。

T-NR 催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO3ˉ +NADH+H＋→ NO2ˉ +NAD＋+H2O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；未反应的NADH会抑制后续的显色反应，用PMS将其中和后再进行后续反应；生成的红色偶氮化合物在 520 nm 有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

自备实验用品及仪器：

可见分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量比色皿/96孔板、冰和蒸馏水。

操作步骤：

1 、分光光度计预热30min 以上，调节波长至520nm ，蒸馏水调零。

2 、样本测定

混匀，显色20min后， 520nm下读取各管吸光值。计算 ΔA测定=A测定- A对照。 ΔA标准=A标准-A空白。

活性计算：

1 、标准曲线绘制：

以 0.8 、0.6 、0.4 、0.2 、0. 1μmol/mL 标准溶液为横坐标， ΔA 标准为纵坐标绘制标准曲线，得到 线性回归方程 y=kx+b ，将 ΔA 测定代入方程得到 x（ μmol/mL）；

2 、S-NR 活性计算

单位的定义： 24h 每 g 土样中产生 1μmol NO2ˉ的量为一个 S-NR 活力单位。

S-NR（U/g）=x×V 标准÷W÷T=24×x

V 标准： 反应体系中加入的标准液体积，0. 1mL；W：样本鲜重，0. 1g；T：反应时间，1/24h。

注意事项：

1 、试剂一、试剂二和试剂四在冰上放置，用完立即放回-20℃。

2 、每个测定管设一个对照管。

3 、ΔA 测定过小（小于 0.01），可延长反应时间（37℃水浴时间） 。