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产品名称:磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:YX-C-C500,YX-W-C500

产品报价:

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价

YX-C-C500

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒

紫外分光光度法

50/48

850

YX-W-C500

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒

微量法

100/96

1600

磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)试剂盒说明书(微量法
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义:

PEPCK(EC 4.1.1.32)广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中,催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的关键酶。

测定原理:

PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和 CO2,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH 氧化生成 NAD+,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PEPCK 活性。

自备实验用品及仪器:

分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

提取液:液体 100mL×1 4℃保存;

试剂一:液体 18 mL×1 瓶, 4℃保存; 

试剂二:液体 16.5uL×1 4℃保存; 

试剂三:粉剂×1 支, -20℃保存;

试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;

样本的前处理:

1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量104 个):提取液体积mL) 500~1000:1 的比例建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20% 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 );8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织:按照组织质量g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例建议称取约 0.1g 组织,加 1mL 提取液,进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3、血清(浆)样品:直接检测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。

2、工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

3、试剂四的配制:临用前加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。

4、将工作液和试剂四置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟。

5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μ L 样本、10μ L 试剂四和 180μ L 工作液,立即混匀,记录 340nm 处初始吸光值A1  1min 后的吸光值 A2,计算 Δ A=A1-A2。

注意:

在该试剂盒中,若Δ A 大于 0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使 Δ A 小于0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。

PEPCK 活性计算:

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清(浆)PEPCK 活力计算

单位定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/mL))=[Δ A×V 反总÷(ε  ×d)×109]÷V ÷T=3215×Δ A 

2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCKnmol/min/mg prot)[Δ A×V 反总÷(ε  ×d)×109]÷(V ×Cpr) ÷T=3215×Δ A÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK ( nmol/min/g  ) = [Δ A×V 反总 ÷ ( ε ×d ) ×109]÷(W ×V  ÷V 样总)÷T=3215×Δ A÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK ( nmol/min/104 cell )= [Δ A×V 反总÷ ( ε  ×d ) ×109]÷(500×V ÷V 样总)÷T=6.43×Δ A

反总:反应体系总体积2×10-4 L;ε NADH 摩尔消光系数6.22×103 L / mol /cm;d: 比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。

b.  96 孔板测定的计算公式如下

1、血清(浆)PEPCK 活力计算

单位定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK(nmol/min/mL))=[Δ A×V 反总÷(ε  ×d)×109]÷V ÷T=6430×Δ A 

2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算

(1)按样本蛋白浓度计算

单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCKnmol/min/mg prot)[Δ A×V 反总÷(ε  ×d)×109]÷(V ×Cpr) ÷T=6430×Δ A÷Cpr

(2)按样本鲜重计算

单位定义:每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK ( nmol/min/g  ) = [Δ A×V 反总 ÷ ( ε ×d ) ×109]÷(W ×V  ÷V 样总)÷T=6430×Δ A÷W

(3)按细菌或细胞密度计算:

单位定义:每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。

PEPCK ( nmol/min/104 cell )= [Δ A×V 反总÷ ( ε  ×d ) ×109]÷(500×V ÷V 样总)÷T=12.86×Δ A

反总:反应体系总体积2×10-4 L;ε NADH 摩尔消光系数6.22×103 L / mol /cm;d: 96 孔板光径0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数, 500 万。


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