产品名称:磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒
产品规格:50管/48样,100管/96样
产品货号:YX-C-C500,YX-W-C500
免费咨询:0551-66107970
货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价 |
YX-C-C500 |
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒 |
紫外分光光度法 |
50管/48样 |
850 |
YX-W-C500 |
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)测试盒 |
微量法 |
100管/96样 |
1600 |
磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶(PEPCK)试剂盒说明书(微量法)
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
PEPCK(EC 4.1.1.32)广泛存在于动物、植物、微生物和细胞中,催化草酰乙酸转化为磷酸烯醇式丙酮酸,是调节糖异生途径的关键酶。
测定原理:
PEPCK 催化草酰乙酸生成磷酸烯醇式丙酮酸和 CO2,丙酮酸激酶和乳酸脱氢酶进一步依次催化NADH 氧化生成 NAD+,在 340nm 下测定 NADH 下降速率,即可反映 PEPCK 活性。
自备实验用品及仪器:
分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:液体 100mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体 18 mL×1 瓶, 4℃保存;
试剂二:液体 16.5uL×1 支,4℃保存;
试剂三:粉剂×1 支, -20℃保存;
试剂四:粉剂×1 支,-20℃保存;
样本的前处理:
1、细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次);8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
2、组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
3、血清(浆)样品:直接检测。
测定步骤:
1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 340nm,蒸馏水调零。
2、工作液的配制:临用前将试剂二和试剂三转移到试剂一中混合溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
3、试剂四的配制:临用前加入 1mL 蒸馏水充分溶解待用;用不完的试剂分装后-20℃保存,禁止反复冻融。
4、将工作液和试剂四置于 37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)预热 5 分钟。
5、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μ L 样本、10μ L 试剂四和 180μ L 工作液,立即混匀,记录 340nm 处初始吸光值A1 和 1min 后的吸光值 A2,计算 Δ A=A1-A2。
注意:
在该试剂盒中,若Δ A 大于 0.1,需将样本用提取液稀释适当倍数后测定,使 Δ A 小于0.1 可提高检测灵敏度。计算公式中乘以相应稀释倍数。
PEPCK 活性计算:
a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1、血清(浆)PEPCK 活力计算
单位定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/mL))=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷V 样÷T=3215×Δ A
2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/mg prot)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=3215×Δ A÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK ( nmol/min/g 鲜 重 ) = [Δ A×V 反总 ÷ ( ε ×d ) ×109]÷(W ×V 样 ÷V 样总)÷T=3215×Δ A÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK ( nmol/min/104 cell )= [Δ A×V 反总÷ ( ε ×d ) ×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=6.43×Δ A
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε :NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d: 比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T:反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1、血清(浆)PEPCK 活力计算
单位定义:每毫升血清(浆)每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/mL))=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷V 样÷T=6430×Δ A
2、组织、细菌或细胞中 PEPCK 活力计算
(1)按样本蛋白浓度计算
单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK(nmol/min/mg prot)=[Δ A×V 反总÷(ε ×d)×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=6430×Δ A÷Cpr
(2)按样本鲜重计算
单位定义:每g 组织每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK ( nmol/min/g 鲜 重 ) = [Δ A×V 反总 ÷ ( ε ×d ) ×109]÷(W ×V 样 ÷V 样总)÷T=6430×Δ A÷W
(3)按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每 1 万个细胞每分钟消耗 1 nmol NADH 定义为一个酶活力单位。
PEPCK ( nmol/min/104 cell )= [Δ A×V 反总÷ ( ε ×d ) ×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=12.86×Δ A
V 反总:反应体系总体积,2×10-4 L;ε :NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L / mol /cm;d: 96 孔板光径,0.5cm;V 样:加入样本体积,0.01 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL;T: 反应时间,1 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数, 500 万。
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