注意：正式测定前务必取 2-3  个预期差异较大的样本做预测定。（微量法）

产品内容 ：

提取液：液体 50mL×1  瓶，4℃保存。

试剂一：液体 15mL×1  瓶，4℃保存，使用前摇匀。

试剂二：液体 5mL×1  瓶，4℃保存。

标准品：粉剂×1 瓶。5mg N- 乙酰氨基葡萄糖，4℃保存。临用前加入 2.27mL 蒸馏水配成 10μmol/mL 的标准溶液。

产品说明 ：

几丁质酶要存在于虾、蟹、昆虫等甲壳类动物的外壳与软体动物的器官(例如乌贼的软骨) ，以 及真菌类的细胞壁中。而几丁质酶(EC 3.2. 1. 14)可催化几丁质水解，具有抵御真菌侵染的作用，成 为抗真菌病害的研究热点。

几丁质酶水解几丁质产生 N- 乙酰氨基葡萄糖，进一步与 3,5-二硝基水杨酸产生棕红色化合物， 在 540nm  处有特征吸收峰，吸收值增加速率反映了几丁质酶的活性。

自备实验用品及仪器：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量玻璃比色皿/96 孔板、研钵/匀浆器、蒸 馏水。

操作步骤 ：

一、粗酶液提取

1. 组织：按照组织质量（g）：提取液体积 (mL)为 1：5~ 10  的比例（建议称取约 0. 1g  组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g ，4℃离心 20min ，取上清，置冰上待测。

2. 真菌：按照细胞数量（104 个）： 提取液体积（mL）为 500~ 1000：1  的比例（建议 500 万细胞加 入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w ，超声 3s ，间隔 7 s ，总时间 3min）； 然后 10000g ，4℃，离心 20min ，取上清置于冰上待检。

3. 培养液：直接测定。

二、测定操作表

1 、可见分光光度计/酶标仪预热 30min 。波长调至 540nm ，蒸馏水调零。

2 、将标准溶液稀释为 5 、4 、3 、2 、1μmol/mL 的标准溶液备用。

3 、在 EP 管中分别加入：

1 、标准曲线的绘制：

以ΔA 标准为 y 轴，标准溶液浓度为 x 轴，绘制标准曲线，得到标准方程 y=kx+b 。将ΔA 测定 带入标准方程中，得到 x（ μmol/mL）

2 、几丁质酶活的计算：

（1） 按照样本重量计算

酶活性定义： 37℃下， 每 g 组织每小时分解几丁质产生 1μmol N- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为一个 酶活性单位。

几丁质酶活性（U/g 鲜重） =x×V 样÷（V 样÷V 样总×W）÷T=x÷W。

（2） 按照蛋白质浓度计算

酶活性定义： 37℃下， 每 mg 蛋白每小时分解几丁质产生 1μmol N- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为一 个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/mg prot）=x×V 样÷ （V 样×Cpr）÷T =x÷Cpr。

（3） 按照细胞数量计算

酶活性定义： 37℃下， 每 104 个细胞每小时分解几丁质产生 1μmol N- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为 一个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/104 cell）=x×V 样÷ （V 样÷V 样总×细胞数量） ÷T =x÷细胞数量。

（4） 按照培养液体积计算

酶活性定义： 37℃下， 每 mL 培养液每小时分解几丁质产生 1μmol N- 乙酰氨基葡萄糖的酶量为 一个酶活性单位。

几丁质酶活性（U/mL）=x×V 样÷V 样÷T =x。

       V 样： 反应体系中样本体积，0. 1mL；V 样总： 加入提取液体积，1mL；W：样本质量，g； Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL；T：反应时间，1h；细胞数量： 以万计。

注意事项 ：

1 、反应结束后尽快进行比色。

2 、OD  值大于 1.5，样品适当稀释再测定， 注意计算公式里乘以稀释倍数； 或者缩短 37℃水浴时间到 X 小时（如 0.5  小时），按照原先计算公式得到的结果再除以 X。