正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定（微量法）

产品内容：

试剂一： 液体 100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂二： 液体 20mL×1 瓶，4℃保存；

标准品： 粉剂×1 支，4℃保存，含 10mg 无水葡萄糖（干燥失重<0.2%），临用前加入 1mL 蒸 馏水溶解备用，4℃可保存 1 周，或者用饱和苯甲酸溶液溶解，可保存更长时间。

标准品准备： 将标准品用蒸馏水稀释至 0.3 、0.25 、0.2 、0. 15 、0. 1 、0.05mg/mL。

产品说明：

还原糖广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中。植物体内的还原糖主要包括葡萄糖、果 糖和麦芽糖等，是最常见的单糖和双糖，其中葡萄糖和果糖不仅是呼吸作用的主要底物，也是进一 步合成蔗糖、淀粉和纤维素的底物。

加热促进碱性溶液中 3,5-二硝基水杨酸溶液与还原糖生成棕红色氨基化合物，在 540nm 有特征 吸收峰； 在一定的浓度范围内，还原糖含量与 540nm 吸光度成线性关系，根据标准曲线，即可求出 样品中还原糖的量。

试验中所需的仪器和试剂：

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96  孔板、研钵、蒸馏水。

操作步骤：

一、样品中还原糖的提取：

1 、 细菌或细胞的处理： 收集细菌或细胞到离心管内， 离心后弃上清； 按照细菌或细胞数量（104   个）： 试 剂一体积（mL）为 500~ 1000：1  的比例（建议 500  万细菌或细胞加入 1mL  试剂一），超声波 破碎细菌或细胞（冰浴， 功率 20％或 200W ，超声 3s ，间隔 10s ，重复 30 次），转移到有盖离心 管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中 40min  并且振荡 8~ 10  次， 8000g，25℃离心 10min ，取 上清供测定用。

2 、 组织的处理： 按照组织质量（g）： 试剂一体积(mL)为 1：5~ 10  的比例（建议称取约 0. 1g 组织， 加入 1mL  试剂一），冰浴匀浆， 转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失），80℃水浴中 40min 并且振荡 8~ 10  次，8000g ，25℃离心 10min ，取上清供测定用。

3 、 血清（浆） 的处理： 按照血清（浆） 体积（mL）： 试剂一体积(mL)为 1：5~ 10  的比例（建议取 0. 1mL  血清（浆）加入 0.9mL 试剂一），冰浴匀浆， 转移到有盖离心管中（防止加热时水分散失）， 80℃水浴中 40min  并且振荡 8~ 10  次，8000g ，25℃离心 10min ，取上清供测定用。

二、测定操作表：

1.     分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 540nm ，蒸馏水调零。

2.     在 EP 管中加入下列试剂：

根据标准管的浓度和吸光度（A 标准管-A 空白管） 建立标准曲线，x 为吸光值，y 为标准品浓 度（mg/mL）。

注意：

1.   每个测定管需设定一个对照管。

2.   如果ΔA 大于 2 ，需要将样本用试剂一稀释，计算公式中乘以相应的稀释倍数。

还原糖含量计算：

1 、根据标准曲线计算样品中还原糖的含量，即将ΔA（A 测定管-A 对照管） 带入 x 计算出 y 值。

2 、按样本鲜重计算：

还原糖(μg/g 鲜重)= 1000×y×V1÷W=1000×y÷W

3 、按样本蛋白浓度计算：

还原糖(μg/mg prot)= （ 1000×y×V1）÷ （V1×Cpr）=1000×y÷Cpr

4 、按细菌或细胞数量计算：

还原糖(μg /104 cell)=1000×y×V1÷500=2×y

5 、按血清（浆） 体积计算：

还原糖(μg/mL)=1000×y×V2÷V3=10000×y 1000：单位换算系数，1mg/mL=1000μg/mL；V1：加入试剂一体积，1mL；V2：加入血清和试 剂一总体积，1 mL；V3：加入血清（浆） 体积，0. 1mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本 质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

注意： 最低检测限为 0.5mg/g  鲜重或 10μg/mg prot