规格：50 管/48 样

产品内容：

试剂一：液体×1  瓶，4℃保存。

试剂二：粉剂×1  瓶，4℃保存。临用前加入 5.0 mL  蒸馏水，混匀。

试剂三：液体×1  支，4℃保存。

产品说明：

GR 是广泛存在于真核和原核生物中的一种黄素蛋白氧化还原酶，是谷胱甘肽氧化还原循环的 关键酶之一(通常昆虫中 GR  被 TrxR 取代)。GR  催化 NADPH 还原 GSSG  生成 GSH，有助于维 持体内 GSH/GSSG 比值。GR  在氧化胁迫反应中对活性氧清除起关键作用，此外 GR 还参与抗坏血 酸-谷胱甘肽循环途径。

GR 能催化NADPH 还原GSSG 再生GSH ，同时不断消耗NADPH 生成NADP+；NADPH 在 340nm 有特征吸收峰，相反 NADP+在该波长无吸收峰； 通过测定 340nm 吸光度下降速率； 来测定 NADPH 脱氢速率，从而计算 GR 活性。

自备仪器和用品：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、移液器、 1mL 石英比色皿和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取

1、组织：按照组织质量（g）：试剂一体积（ml）1：5- 10 的比例（建议称取约 0. 1g 组织， 加入 1ml 试剂一进行冰浴匀浆。10000rpm ，4℃离心 10min ，取上清置冰上待测。

2、细菌、真菌：按照细胞数量（ 104 个）： 试剂一体积（ml）为 500- 1000：1 的比例（建议 500 万 细胞加入 1ml 试剂一），冰浴超声超声破碎细胞（功率 300w，超声 3s ，间隔 7s ，总时间 3min）； 然后 10000rpm ，4℃，离心 10min ，取上清置于冰上待测。

二、GR  测定操作：

（1）分光光计预热 30 min  以上，调节波长到 340 nm ，蒸馏水调零。

（2）试剂一置于25℃(普通物质)或者 37℃(哺乳动物)中预热 30min 以上。

（3）空白管：取1mL  石英比色皿，加入 850µL  试剂一，100µL  试剂二，50µL  试剂三，充分混 匀，于 340nm  处测定 10 s 和 190 s  吸光度，记为 A 空 1  和 A 空 2 ，△A 空白管= A  空 1 ﹣ A 空 2 。

（4）测定管：取 1mL  石英比色皿，加入 750µL  试剂一，100µL  试剂二，100µL  上清液，50µL 试剂三，充分混匀，于 340nm  处测定 10 s 和 190 s 吸光度，记为 A 测 1 和 A 测 2 ，△A 测定 管= A 测 1 ﹣ A 测 2。

注意： 空白管只需要测定一次。

三、GR  活性计算：

1.     按蛋白浓度计算

活性单位定义： 在一定温度中， pH8.0  条件下，每 毫克蛋白每分钟催化 1µmol NADPH  氧化。 GR  酶活(U/mg prot)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V  反总×106] ÷(Cpr×V 样)÷T

=0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷Cpr

2.     按样本质量计算

活性单位定义： 在一定温度中， pH8.0  条件下，每克样本每分钟催化 1µmol NADPH 氧化。

GR  酶活(U/g)= [ (△A 测定管-△A 空白管)÷ε÷d×V  反总×106] ÷(W×V 样÷V  样总)÷T =0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷W

3.     按细胞数量计算

活性单位定义： 在一定温度中，pH8.0 条件下，每 104 个细胞每分钟催化 1µmol NADPH 氧化。

GR 酶活(U/104 cell)= [ (△A  测定管-△A  空白管)÷ε÷d×V 反总×106] ÷(细胞数量×V 样÷V 样 总)÷T=0.536×(△A 测定管-△A 空白管)÷细胞数量

ε：NADPH 摩尔消光系数 6.22×103L/mol/cm ；V  反总： 反应体系总体，1000µL=0.001 L；106： 1 mol=1×106µmol；Cpr：上清液蛋白浓度（ mg/mL）；V  样： 加入反应体系中上清液体积，100µL =0. 1 mL；V 样总： 加入提取液体积ˈ   1mL；W ，样本质量，g；T：反应时间，3 min。

注意事项：

1.    样品处理等过程均需要在冰上进行，且须在当日测定酶活力，匀浆液避免反复冻融；

2.    试剂二须现配现用，配置完后，置于冰上；

3.    测定前须先用 1～2 个样做预实验， 确保 180s 内吸光值变化呈线性，哺乳动物组织一般须用试剂 一稀释 2～5 倍；

4.    细胞中 GR  活性测定时，细胞数目须在 300  万-500  万之间，细胞中 GR 的提取时可加试剂一 后研磨或超声波处理，不能用细胞裂解液处理细胞。