产品名称:乙酰辅酶A羧化酶(ACC)测试盒
产品规格:50管/24样,100管/48样
产品货号:YX-C-B411,YX-W-B411
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货号
产品名称
检测方法
规格
售价(元)
YX-C-B411
乙酰辅酶A羧化酶(ACC)测试盒
可见分光光度法
50管/24样
850
YX-W-B411
乙酰辅酶A羧化酶(ACC)测试盒
微量法
100管/48样
1600
乙酰辅酶 A 羧化酶(ACC)活性检测试剂盒说明书(可见分光光度法)
注意:正式测定之前选择 2-3 个预期差异大的样本做预测定。
产品简介:
乙酰辅酶 A 羧化酶(Acetyl-CoA carboxylase,ACC)在生物体内催化乙酰辅酶 A 羧化生成丙二酰辅酶 A,是脂肪酸和许多次生代谢产物合成的关键酶。ACC 的活性在一定程度上决定了脂肪酸的合成速度和含油量的高低。
ACC 能够催化乙酰辅酶 A、NaHCO3 和 ATP 生成丙二酰辅酶 A、ADP 和无机磷,钼蓝与磷酸根生成 660nm 有特征吸收峰的物质,通过钼酸铵定磷法测定无机磷的增加量来测定 ACC 活性。
试验中所需的仪器和试剂:
可见分光光度计、天平、低温离心机、1mL 玻璃比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、漩涡震荡仪、水浴锅、蒸馏水、冰盒、EP 管。
产品内容:
提取液一:液体 60mL×1 瓶,4℃保存;
提取液二:液体 0.6mL×1 支,-20℃避光保存;
试剂一:液体 50mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加入 12.5mL 试剂一,充分溶解待用;可分装后-20℃保存,避免反复冻融;
试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃保存。临用前加入 6mL 双蒸水,充分溶解待用;可分装后-20℃保存, 避免反复冻融;
试剂四:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 15mL 双蒸水,溶解后 4℃保存一周;
试剂五:粉剂×1 瓶,4℃保存。临用前加入 15mL 双蒸水,溶解后 4℃保存一周;
试剂六:液体 15mL×1 瓶,室温保存;
标准品:10μmol/mL 标准磷贮备液 1mL×1 支,4℃保存;
提取液的配制:按提取液一:提取液二=990:10(V:V)的比例配制,根据样本量现配现用, 禁止将提取液二一次性全部加入提取液一混匀分装待用。
工作液(定磷剂)的配制:按 H2O:试剂四:试剂五:试剂六=2:1:1:1 的比例配制,配好的工作液应为浅黄色。若变色则试剂失效,若是蓝色则为磷污染,工作液应现配现用。
注意:配试剂最好用新的烧杯、玻璃棒和玻璃移液器,也可以用一次性塑料器皿,避免磷污染
操作步骤:
一、粗酶液提取:
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL提取液)进行冰浴匀浆,然后,8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
细菌或细胞:收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细胞加入 1mL提取液),冰浴超声波破碎细胞(功率 300w,超声 3 秒,间隔 7 秒,总时间 3min);然后 8000g,4℃,离心 10min,取上清置于冰上待测。
血清(浆):直接测定。
二、测定步骤:
1、 分光光度计预热 30min 以上,调节波长至 660nm,蒸馏水调零。
2、 将 10μmol/mL 标准液用蒸馏水稀释为 1.25、0.625、0.3125、0.15625、0.078μmol/mL 的标准溶液备用。
3、 操作表:(在 1.5ml 离心管中依次加入下列试剂)
酶促反应:
试剂名称
对照管
测定管
试剂一(µL)
450
试剂二(µL)
-
250
试剂三(µL)
-
200
样本(µL)
50
50
37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)准确反应 30min 后,沸水浴 5min(盖紧, 以防止水分蒸发散失),冷却后,10000g, 25℃离心 5min,取上清。
定磷反应:
试剂名称
标准管
空白管
对照管
测定管
标准溶液(μL)
100
-
-
-
H2O(µL)
-
100
-
-
上清液(µL)
-
100
100
工作液(µL)
900
900
900
900
混匀,37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)反应 30min,冷却至室温,在 660nm 处,蒸馏水调零,记录各管吸光值 A,分别记为 A 标准管、A 空白管、A 对照管和 A 测定管。ΔA=A 测定管-A 对照管,ΔA 标准=A 标准管-A 空白管。标准管、空白管只要做一次即可,每个测定管需要设一个对照管。
1、 标准曲线的绘制:
以各个标准溶液的浓度为 x 轴,其对应的ΔA 标准为 y 轴,绘制标准曲线,得到标准方程 y=kx+b,将ΔA 带入方程得到 x(μmol/mL)
2、 ACC 活性的计算:
(1)按蛋白浓度计算
酶活定义:每小时每毫克组织蛋白产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位
ACC 酶活(U /mg prot)=x×V 总÷(V 样×Cpr)÷T=20x÷Cpr。
(2)按样本质量计算
酶活定义:每小时每 g 组织产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC 酶活(U /g 鲜重)=x×V 总÷(V 样×W÷V 样总)÷T=20x÷W。
(3)按照细菌或细胞数量计算
酶活定义:每小时每 104 个细菌或细胞产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC 酶活(U /104 cell)=x×V 总÷(V 样×细胞数量(万个)÷V 样总)÷T=20x÷细胞数量(万个)。
(4)按液体体积计算
酶活定义:每小时每 mL 液体产生 1μmol 无机磷的量为一个 ACC 活力单位。
ACC 酶活(U /mL)=x×V 总÷V 样÷T=20x。
V 总:酶促反应总体积,0.5mL;V 样:加入样本体积,0.05mL;V 样总:加入提取液体积,1mL;T:反应时间,0.5h;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL,蛋白浓度自行测定;W:样本鲜重,g。
注意事项
1、 工作液(定磷剂)应现配现用,正常颜色为浅黄色,如有变色或变蓝则均为失效。
2、 此法具有微量、灵敏、快速的特点。所以对测定所用试管或 EP 管等试验器材均要求严格无磷。
3、 显色结束后应立即检测。
4、 当ΔA 大于 1 时,建议将样本用提取液稀释后再进行测定。
三、ACC 活性计算
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