产品名称:谷氨酰胺合成酶(GS)测试盒
产品规格:50管/24样,100管/48样
产品货号:YX-C-A807,YX-W-A807
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货号
产品名称
检测方法
规格
售价(元)
YX-C-A807
谷氨酰胺合成酶(GS)测试盒
可见分光光度法
50管/24样
280
YX-W-A807
谷氨酰胺合成酶(GS)测试盒
微量法
100管/48样
550
谷氨酰胺合成酶(GS)活性检测试剂盒说明书(微量法)
注意:正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定。
产品内容:
提取液: 液体 60mL×1 瓶,4℃保存。
试剂一: 液体 10mL×1 瓶,-20℃保存。
试剂二: 液体 10mL×1 瓶,-20℃保存。
试剂三: 粉剂×2 瓶, -20℃保存。用时每瓶加入 5mL 双蒸水充分溶解备用,用不完的试剂仍-20℃ 分装保存。
试剂四: 液体 15mL×1 瓶,4℃保存。
产品说明:
GS (EC 6.3. 1.2)主要存在于植物中,是生物体内氨同化的关键酶之一,催化铵离子和谷氨酸 合成谷氨酰胺,不仅可以防止过多的铵离子对生物有毒性,而且谷氨酰胺也是氨的主要储存和运 输形式。
GS 在 ATP 和 Mg2+存在下,催化铵离子和谷氨酸合成谷氨酰胺; 谷氨酰胺进一步转化为γ─谷氨 酰基异羟肟酸,在酸性条件下与铁形成红色的络合物; 该络合物在 540nm 处有最大吸收峰。
所需的仪器和用品
可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量玻璃比色皿/96 孔板、研 钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤:
一、样本测定的准备
1 、细菌、细胞或组织样品的制备:细菌或培养细胞: 先收集细菌或细胞到离心管内, 离心后弃上清; 按照细菌或细胞数量(104 个): 提 取液体积(mL)为500~ 1000:1 的比例(建议500万细菌或细胞加入1mL 提取液) ,超声波破碎细 菌或细胞(冰浴,功率20%或200W ,超声3s ,间隔10s ,重复30 次) ;8000g 4℃离心10min ,取上 清,置冰上待测。
组织: 按照组织质量(g):提取液体积(mL)为1:5~10 的比例(建议称取约0. 1g组织,加入1mL 提取液) ,进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min ,取上清,置冰上待测。
2 、血清(浆) 样品: 直接检测。
二、测定步骤
1 、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 540nm ,蒸馏水调零。
2 、在 EP 管中加入下列试剂:
试剂名称(µL) |
测定管 |
对照管 |
试剂一 |
160 |
|
试剂二 |
|
160 |
试剂三 |
70 |
70 |
样本 |
70 |
70 |
混匀,37℃(哺乳动物) 或 25℃(其他物种) 准确水浴 30min |
||
试剂四 |
100 |
100 |
混匀, 静置 10min 后,5000g ,常温离心 10min,取 200µL 上清液至微量玻璃比色皿或 96 孔板中, 测定 540nm 处的吸光值 A 。△A=A 测定管-A 对照管。
每个测定管需设一个对照管。
三、GS 活力单位的计算
1、用微量玻璃比色皿测定的计算公式如下
(1) 按血清(浆) 体积计算
单位定义: 每 mL 血清(浆) 在每 mL 反应体系中每 min 使 540 下吸光值变化 0.01 定义为一 个酶活力单位。
GS(U/mL)=∆A×V 反总÷V 样÷0.01÷T =19×∆A
(2) 按样本蛋白浓度计算
单位的定义: 每 mg 组织蛋白在反应体系中每 min 使 540nm 下吸光值变化 0.01 定义为一个酶活 力单位。
GS(U/mg prot)=∆A×V 反总÷ (Cpr×V 样) ÷0.01÷T =19×∆A÷Cpr
(3) 按样本鲜重计算
单位的定义: 每 g 组织在反应体系中每 min 使 540nm 下吸光值变化 0.01 定义为一个酶活力单 位。
GS(U/g 鲜重) =∆A×V 反总÷ (V 样÷V 样总×W)÷0.01÷T =19×∆A÷W
(4) 按细菌或细胞数量计算
单位定义: 每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.01定义为一个 酶活力单位。
GS(U/104 cell)=∆A×V反总÷ (500×V样÷V样总) ÷0.01÷T =0.038×∆A
V 反总: 反应体系总体积,400µL=0.4mL;V 样: 加入样本体积,70µL=0.07mL;V 样总: 加 入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g; 500:细菌或细胞总数,500 万。
2. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(1) 按血清(浆) 体积计算
单位定义: 每 mL 血清(浆) 在每 mL 反应体系中每 min 使 540 下吸光值变化 0.005 定义为一 个酶活力单位。
GS(U/mL)=∆A×V 反总÷V 样÷0.005÷T =38×∆A
(2) 按样本蛋白浓度计算:
单位的定义: 每 mg 组织蛋白在反应体系中每 min 使 540nm 下吸光值变化 0.005 定义为一个酶 活力单位。
GS(U/mg prot)=∆A×V 反总÷ (Cpr×V 样) ÷0.005÷T =38×∆A÷Cpr
(3) 按样本鲜重计算:
单位的定义: 每 g 组织在反应体系中每 min 使 540nm 下吸光值变化 0.005 定义为一个酶活力单 位。
GS(U/g 鲜重) =∆A×V 反总÷ (V 样÷V 样总×W)÷0.005÷T =38×∆A÷W
(4) 按细菌或细胞数量计算
单位定义: 每1万个细菌或细胞在每mL反应体系中每min使540nm下吸光值变化0.005定义为一个 酶活力单位。
GS(U/104 cell)=∆A×V反总÷ (500×V样÷V样总) ÷0.005÷T =0.076×∆A
V 反总: 反应体系总体积,400µL=0.4mL;V 样: 加入样本体积,70µL=0.07mL;V 样总: 加 入提取液体积,1 mL;T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样品质量,g; 500:细菌或细胞总数,500 万。
注意事项:试剂一、试剂二可能会有析出,可以重悬后使用,反应后取上清测定。
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