测定意义：

蛋白质羰基是多种氨基酸在蛋白质的氧化修饰过程中的早期标志，其含量高低表明蛋白质氧化损伤程度的大小，是衡量蛋白质氧化损伤的主要指标。

测定原理：

羰基与 2,4-二硝基苯肼反应生成红色 2,4-二硝基苯腙，在 370nm 处有特征吸收峰。

自备实验用品及仪器：

天平、恒温水浴锅、低温离心机、漩涡震荡仪、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、蒸馏水、无水乙醇、乙酸乙酯。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：粉剂 0.1g×5 支，4℃避光保存。（使用前根据样品数，每支加 1mL 水溶解，每支为 10 个样品用量）

试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃保存。

试剂四：液体 15mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：根据测定样品量，将乙酸乙酯和无水乙醇等体积混合。试剂六：液体 60mL×1 瓶，4℃保存。

样品处理：

1. 组织样品：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，于 4℃，4000g 离心 10min，取上清，加入 0.1mL 试剂一， 室温放置 10min，4℃，10000g 离心 10min，取上清待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清置于冰上待测。

3. 血清等液体样本：直接测定。

测定步骤和操作表：

1、分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 370nm。

2、操作表

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下
1. 按照样本蛋白浓度计算
蛋白质羰基含量（ μ mol/mg prot ） = [Δ A370×V 反总÷ （ ε ×d ） ]÷(V 样×Cpr)
=0.227×Δ A370÷Cpr
2. 按照样本重量计算
蛋白质羰基含量（ μ mol/g 鲜重）= [Δ A370×V 反总÷（ε ×d）]÷(W ×V 样÷V 样总)
=0.227×Δ A370÷W
3. 按照细胞数量计算
蛋白质羰基含量（μ mol/104cell）= [Δ A ×V 反总÷（ε ×d）]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样
总) =0.227×Δ A370÷细胞数量
4. 按照液体体积计算
蛋白质羰基含量（μ mol/mL）= [Δ A370×V 反总÷（ε  ×d）]÷V 样=0.227×Δ A370
V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε ：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
1. 按照样本蛋白浓度计算
蛋白质羰基含量（ μ mol/mg prot ） = [Δ A370×V 反总÷ （ ε ×d ） ]÷(V 样×Cpr)
=0.454×Δ A370÷Cpr
2. 按照样本重量计算
蛋白质羰基含量（ μ mol/g 鲜重）= [Δ A370×V 反总÷（ε ×d）]÷(W ×V 样÷V 样总)
=0.454×Δ A370÷W
3. 按照细胞数量计算
蛋白质羰基含量（μ mol/104cell）= [Δ A ×V 反总÷（ε ×d）]÷(细胞数量 ×V 样÷V 样
总) =0.454×Δ A370÷细胞数量
4. 按照液体体积计算
蛋白质羰基含量（μ mol/mL）= [Δ A370×V 反总÷（ε  ×d）]÷V 样=0.454×Δ A370
V 反总：反应体系总体积，0.3 mL；ε ：羰基毫摩尔消光系数，22 L/mmol/cm；d：96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.06 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL，W：样本质量，g