产品内容：

提取液：100mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：液体20mL×1 瓶， 4℃保存；

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；

试剂三：粉剂×1 支，-20℃保存；

测定意义

HK（EC 2.7.1.1）广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，是葡萄糖分解过程中的第一个关键酶，催化葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖是糖酵解和磷酸戊糖途径的交叉点。HK 催化葡萄糖合成6-磷酸葡萄糖，6-磷酸葡萄糖脱氢酶进一步催化6-磷酸葡萄糖脱氢生成NADPH，NADPH 在340nm  有特征吸收峰。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、恒温水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

操作步骤：

一 、样本的前处理

1、细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（104个）：提取液体积（mL）为500~1000：1 的比例（建议500 万细菌或细胞加入1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率20％或200W，超声3s，间隔10s，重复30 次）；8000g 4℃离心10min， 取上清，置冰上待测。

2、组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10 的比例（建议称取约0.1g 组织，加入1mL 提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心10min，取上清，置冰上待测。

3、血清（浆）样品：直接检测。

二、测定步骤

1、 分光光度计或酶标仪预热30min 以上，调节波长至340nm，蒸馏水调零。

2、 样本测定

① 在试剂二中加入18mL 试剂一充分溶解，置于37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴5min； 用不完的试剂4℃保存一周；

② 在试剂三中加入1mL 试剂一，充分溶解待用；用不完的试剂4℃保存一周；

③ 在微量石英比色皿或96 孔板中加入10μL 样本、10μL 试剂三和180μL 试剂二，混匀，立即记录340nm 处20s  时的吸光值A1  和 5min20s 后的吸光值A2，计算ΔA=A2-A1。

注意：不同匀浆组织中HK 活力不一样，做正式试验之前请做1-2 只预试，若ΔA>0.5，则说明组织活力太高，必须用提取液稀释成适当浓度匀浆上清液（计算公式中乘以相应稀释倍数），或缩短反应时间至2min,使ΔA<0.5，以提高检测灵敏度。

HK 活性计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

1、血清（浆）HK 活性

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（U/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=643×ΔA 2、组织、细菌或细胞中HK 活性

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成1 nmol  的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（U/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T：反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总数，500 万。

b. 用96 孔板测定的计算公式如下

1、血清（浆）HK 活性

单位的定义：每毫升血清（浆）在每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（U/mL）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷V 样÷T=1286×ΔA 2、组织、细菌或细胞中HK 活性

（1） 按样本蛋白浓度计算

单位的定义：每mg 组织蛋白每分钟生成1 nmol  的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（U/mg prot）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr

（2） 按样本鲜重计算

单位的定义：每g 组织每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（U/g 鲜重）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

（3） 按细菌或细胞密度计算

单位的定义：每1 万个细菌或细胞每分钟生成1 nmol 的NADPH 定义为一个酶活力单位。

HK（U/104 cell）＝[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA

V 反总：反应体系总体积，2×10-4 L；ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×103 L / mol /cm；d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：加入样本体积，0.01 mL；V 样总：加入提取液体积，1 mL；T： 反应时间，5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本质量，g；500：细菌或细胞总

数，500 万。