正式测定前务必取2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

NR（EC 1.7.1.3）广泛存在于植物中，是植物硝态氮转化为氨态氮的关键酶，也是诱导酶，对作物的产量和品质有影响。

测定原理

NR催化硝酸盐还原为亚硝酸盐，NO₃ˉ+NADH+H^＋→ NO₂ˉ+NAD^＋+H₂O；产生的亚硝酸盐能够在酸性条件下，与对–氨基苯磺酸及α-萘胺定量生成红色偶氮化合物；生成的红色偶氮化合物在540nm有最大吸收峰，可用分光光度法测定。

需自备的仪器和用品

可见分光光度计/酶标仪、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

诱导剂储备液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

提取液：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 10mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂二：液体 5mL×1 瓶，-20℃保存。

试剂三：液体 5mL×1 瓶，4℃保存（如出现结晶析出，60度水浴溶解后使用）；

试剂四：液体 5mL×1 瓶，4℃保存。

试剂五：标准储备液 1mL，-20℃保存。

诱导剂应用液的配制：用时将诱导剂储备液稀释10倍，即取10mL诱导剂储备液加90mL蒸馏水，充分混匀。

0.1umol/mL 的标准液的配制：用时将试剂五稀释100倍，即取0.1ml试剂五加9.9mL蒸馏水，充分混匀。

样品测定的前处理

1、取适量诱导剂于烧杯中，将新鲜标本洗净，滤纸吸干，放入诱导剂应用液中（淹没即可），

浸泡2h，取出样本，滤纸吸干后，-20℃冷冻30min，取出样本，滤纸吸干。（根据需要进行诱导处理）

2、按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为1：5~10的比例（建议称取约0.1g组织，加入1mL提取液），进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤

1、分光光度计或酶标仪预热30min以上，调节波长至540nm，蒸馏水调零。

2、样本测定（在EP管或96孔板中加入下列试剂）

混匀，显色 20min，540nm 处比色

注意：标准管和空白管只需测一次，每个测定管设一个对照管。

NR 活性计算：

（1）按样本鲜重计算：

单位定义：每小时每 g 鲜重样品中催化产生1μmol NO₂ˉ的量为一个NR活力单位。

NR（μmol/h/g 鲜重）= (C 标准管×V1)×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷(W×V1÷V2)÷T=0.2×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷W

（2）按样本蛋白浓度计算：

单位定义：每小时每 mg 组织蛋白催化产生1μmol NO₂ˉ的量为一个NR活力单位。

NR（μmol/h/mg prot）=(C 标准管×V1)×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷(V1×Cpr)÷T=0.2×（A 测定管-A 对照管）÷（A 标准管-A 空白管）÷Cpr

C 标准管：标准管浓度，0.1μmol/mL；V1：加入样本体积：0.02mL；V2：加入提取液体积，

1mL；T：反应时间，0.5h；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样本鲜重，g。