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产品名称:线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)测试盒

产品规格:50管/48样,100管/96样

产品货号:YX-C-B104,YX-C-B104

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产品名称

检测方法

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售价(元)

YX-C-B104

线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)测试盒

紫外分光光度法

50/48

750

YX-W-B104

线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)测试盒

微量法

100/96

1400

线粒体异柠檬酸脱氢酶(ICDHm)活性测定试剂盒说明书(紫外分光光度法

正式测定前务必取 2-3个预期差异较大的样本做预测定

测定意义

ICDHmEC 1.1.1.41)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中,在三羧酸循中催化异柠檬酸生成α-酮戊二酸,同时将NAD+还原NADH,是三羧酸循环的限速酶之一,其催化的反应是细胞 NADH 主要来源之一。

测定原理

ICDHm催化 NAD+还原生成NADH,导致340nm处光吸收上升。

需自备的仪器和用品

紫外分光光度计、水浴锅、台式离心机、可调式移液器、1 mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制

试剂一:50mL×瓶,-20℃保存;

试剂二:10mL×瓶,-20℃保存;

试剂三:1mL×支,-20℃保存;

试剂四:液体 60mL×瓶,4℃保存;

试剂五:粉剂×支,4℃保存;

试剂六:粉剂×支,-20℃保存;

试剂七:粉剂×支,-20℃保存临用前加入3mL蒸馏水充分混匀待用,现配现用。

工作液的配制:临用前把试剂五、试剂六转移到试剂四中混合溶解待用;用不完的试剂 4保存一周;

样本的前处理:

组织、细菌或细胞中胞浆蛋白与线粒体蛋白的分离:

1、 称取约0.1g组织或收集500万细菌或细胞,加入1mL试剂一和10uL试剂三,用冰浴匀浆器或研钵匀浆。

2、 将匀浆600g4℃离心 5min

3、 弃沉淀,将上清液移至另一离心管中,11000g4℃离心 10min

4、 上清液即胞浆提取物,可用于测定从线粒体泄漏的 ICDHm(此步可选做)。

5、 在步骤④的沉淀中加入200uL试剂二和2uL试剂三,超声波破碎(冰浴,功率20%或200W,超声3秒,间隔10秒,重复30次),用于线粒体 ICDHm活性测定。

测定步骤

1、分光光度计预热30min以上,调节波长至340nm处,蒸馏水调零。

2、工作液于37℃(哺乳动物)或 25℃(其它物种)孵育 5min

3、在1mL石英比色皿中依次加入60μL试剂七、80μL样本和1mL工作液,混匀,立即记340nm20s时的吸光值A12min20s时的吸光值A2,计算 ΔA=A2-A1

ICDHm 活性计算

1) 按样本蛋白浓度计算

单位的定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成1 nmolNADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHm活性(nmol/min /mg prot)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(Cpr×V÷T

=1145×ΔA÷Cpr

2) 按样本鲜重计算

单位的定义:每 g 组织每分钟生成1 nmolNADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHmnmol/min /g 鲜重)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(W ×V样÷V样总÷T

=231.3×ΔA÷W

3) 按细菌或细胞密度计算

单位的定义:每1万个细菌或细胞每分钟生成1 nmolNADH 定义为一个酶活性单位。

ICDHm活性(nmol/min/104cell)=[ΔA×V反总÷(ε×d)×109]÷(500×V样÷V样总)÷T=0.463×ΔA

反总:反应体系总体积,1.14×10 -3 L;ε:NADH 摩尔消光系数,6.22×103 L/mol/cmd

比色皿光径,1cm样:加入样本体积,0.08 mL样总:加入提取液体积,0.202 mLT:反应时间,2minCpr:样本蛋白质浓度,mg/mLW:样本质量,g500:细菌或细胞总数,500 


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