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产品名称:辅酶ⅡNADP(H)测试盒

产品规格:50管/24样,100管/96样

产品货号:LE-1-340,LE-2-340

产品报价:

免费咨询:0551-66107970

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货号

产品名称

检测方法

规格

售价(元)

LE-1-340

辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒

可见分光光度法

50管/24样

550

LE-2-340

辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒

微量法

100管/48样

1000

辅酶ⅡNADP(H)含量试剂盒说明书(微量法

测定意义:

辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中,NADP+ NADPH 含量测定可以计算 NADP(NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值,其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一,而且在 PPP 途径、生物合成和抗氧化代谢中具有重要调控作用。

测定原理:

分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+ NADPH。NADPH 通过 PMS 的递氢作用,使氧化型噻唑蓝(MTT)还原为甲瓒,570nm 下检测吸光值,从而测定 NADPH 含量。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还原 NADP+ NADPH,从而检测 NADP+含量。

自备实验用品及仪器:

可见分光光度计/酶标仪、台式离心机、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研钵、冰和蒸馏水。

试剂的组成和配制:

酸性提取液:液体 50mL×1 4℃保存; 碱性提取液:液体 50mL×1 4℃保存; 

试剂一:液体 10 mL×1 4℃保存;

试剂二:粉剂×1 -20 ℃保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4 ℃保存一周; 

试剂三:粉剂×1 瓶,-20℃避光保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周; 

试剂四:粉剂×1 瓶,4 ℃避光保存,用时加入 3mL 蒸馏水,混匀;溶解后 4℃保存一周;

试剂五:液体 3.6mL×1 4 ℃保存;

试剂六:液体 30mL×1 4 ℃保存; 

试剂七:液体 50mL×1 4 ℃保存。

NADP+ NADPH 的提取:

1、血清(浆) NADP+ NADPH 的提取

NADP+的提取:按照血清(浆)体积(mL):酸性提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议取 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 酸性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min; 500μ L 上清液,加入 500μ L 碱性提取液使之中和, 混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:按照血清(浆)体积(mL):碱性提取液体积(mL) 1:5~10 的比例(建议取约 0.1mL 血清(浆),加入 1mL 碱性提取液),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min; 500μ L 上清液,加入 500μ L 酸性提取液使之中和, 混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

2、组织中 NADP+ NADPH 的提取:

NADP+的提取:按照组织质量(g):酸性提取液体积mL) 1:5~10 的比例建议取约 0.1g组织,加入 1mL 酸性提取液,冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min; 500μ L 上清液,加入 500μ L 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:按照组织质量(g):碱性提取液体积(mL) 1:5~10 的比例建议取约 0.1g组织,加入 1mL 碱性提取液,冰浴研磨,95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min; 500μ L 上清液,加入 500μ L 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

3、细胞或细菌中 NADP+ NADPH 的提取:

NADP+的提取:先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量104 个):酸性提取液体积(mL) 500~1000:1 的比例建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 酸性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20% 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后,10000g 4 ℃离心 10min;取 500μ L 上清液,加入 500μ L 碱性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

NADPH 的提取:

先收集细胞或细菌到离心管内,弃上清,按照细菌或细胞数量(104 个):碱性提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 碱性提取液),超声波破碎(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次),95℃水浴 5min(盖紧,以防止水分散失);冰浴中冷却后10000g 4 ℃离心 10min;取 500μ L 上清液,加入 500μ L 酸性提取液使之中和,混匀,10000g 4 ℃离心 10min,取上清,置冰上待测。

测定步骤:

1、分光光度计或酶标仪预热 30min 以上,调节波长至 570nm,蒸馏水调零。

2、加样表(在 1.5mL 棕色EP 管中按下表依次加样):

试剂名称(μ L)

对照管

测定管

样本

20

20

试剂一

80

80

试剂二

30

30

试剂三

30

30

试剂四

30

30

试剂五

30

30

试剂六

200

混匀,室温避光静置 20min

试剂六

 

200

充分混匀,静置 5min 后,20000g,25℃离心 5min,弃上清,沉淀中加入:

试剂七

400

400

混匀,取 200μ L 转移至微量石英比色皿或 96 孔板中570nm 下读取对照吸光值 A1 和测定管吸光值 A2,计算△A=A2-A1。

注意事项:

1、如果一次性测定样本数较多,可将试剂一、二、三和四按比例配成混合液。

2、对照管和测定管的测定步骤的区别:对照管加完试剂一、二、三、四和五后必须马上加试剂六;测定管加完试剂一、二、三、四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。

3、反应过程中注意避光。

4、由于每一个测定管需要设一个对照管,本试剂盒 100 管保证测 48  NADP+ NADPH. NADP+ NADPH 含量的计算

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(一)NADP+含量的计算
1、血清(浆)中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL)=[4.57× (△A -0.062)×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 91.4×(△A -0.062)
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+ (nmol/mg prot)=[ 4.57×(△A -0.062)×V1) ]÷(V1×Cpr)= 4.57×(△A -0.062)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADP+ (nmol/g 鲜重)= [ 4.57×(△A -0.062)×V1) ]÷(W×V1÷V2)=9.14×(△A -0.062)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADP+ (nmol/104 cell)=[ 4.57×(△A -0.062)×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0183×(△A -0.062)
(二)NADPH 含量的计算
1、血清(浆)中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL)=[7.2× (△A -0.072)×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 144× (△A -0.072)
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot)= [7.2× (△A -0.072)×V1) ]÷(V1×Cpr)= 7.2× (△A -0.072)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重)= [7.2× (△A -0.072)×V1) ]÷(W×V1÷V2)=14.4× (△A -0.072)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell)= [7.2× (△A -0.072)×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0288× (△A-0.072)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
(一)NADP+含量的计算
1、血清(浆)中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/mL)=[9.14× (△A -0.062)×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 182.8×(△A -0.062)
2、组织、细菌或细胞中 NADP+含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADP+ (nmol/mg prot)=[ 9.14×(△A -0.062)×V1) ]÷(V1×Cpr)= 9.14×(△A -0.062)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADP+ (nmol/g 鲜重)= [ 9.14×(△A -0.062)×V1) ]÷(W×V1÷V2)=18.28×(△A -0.062)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADP+ (nmol/104 cell)=[ 9.14×(△A -0.062)×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0366×(△A -0.062)
(二)NADPH 含量的计算
1、血清(浆)中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/mL)=[14.4× (△A -0.072)×V1) ]÷(V3×V1÷V2)= 288× (△A -0.072)
2、组织、细菌或细胞中 NADPH 含量计算

(1)按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot)= [14.4× (△A -0.072)×V1) ]÷(V1×Cpr)= 14.4× (△A -0.072)÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重)= [14.4× (△A -0.072)×V1) ]÷(W×V1÷V2)=28.8× (△A -0.072)÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell)= [14.4× (△A -0.072)×V1) ]÷(500×V1÷V2)=0.0576× (△A-0.072)
V1:加入反应体系中样本体积,0.02mL;V2:加入提取液体积,2mL;V3:加入血清(浆)体积:0.1mL;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL; W:样本质量,g;500:细胞或细菌总数,500 万。
注意:最低检测限为 1nmol/mL 或 1nmol/g 鲜重 或 0.01nmol/mg prot


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