产品名称：辅酶ⅡNADP(H)测试盒
产品规格：50管/24样,100管/96样
产品货号：LE-1-340,LE-2-340
产品报价：
免费咨询：0551-66107970
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货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价（元） |
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LE-1-340 |
辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒 |
分光光度法 |
50管/24样 |
550 |
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LE-2-340 |
辅酶ⅡNADP(H)含量测试盒 |
微量法 |
100管/48样 |
1000 |
货号：LE-1-340
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义：
辅酶ⅡNADP(H)广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞中，NADP+和 NADPH 含量测定可以计算 NADP（NADPH + NADP+ )含量和 NADPH/NADP+比值，其变化与磷酸戊糖途径和生物合成以及抗氧化反 应密切相关。NADPH/NADP+比值不仅是细胞氧化还原态的主要标志之一，而且在 PPP 途径、生物合成和 抗氧化代谢中具有重要调控作用。
测定原理：
分别用酸性和碱性提取液提取样品中 NADP+和 NADPH 。NADPH 通过 PMS 的递氢作用，使氧化型 噻唑蓝（MTT）还原为甲瓒，570nm 下检测吸光值，从而测定 NADPH 含量 。利用 6-磷酸葡萄糖脱氢酶还 原 NADP+为 NADPH，从而检测 NADP+含量。
产品内容：
酸性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；
碱性提取液：50mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体 15 mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支 ，-20 ℃保存，用时加入 4ml 蒸馏水，混匀；用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂三：粉剂×1 支 ，-20℃保存，用时加入 4ml 蒸馏水，混匀；用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂四：粉剂×1 支 ，4 ℃保存，用时加入 4ml 蒸馏水，混匀；用不完的试剂 4℃保存一周；
试剂五：液体 1.8mL×1 支，4 ℃保存；
试剂六：液体 30mL×1 瓶，4 ℃保存；
试剂七：液体 50mL×1 瓶，4 ℃保存。
自备仪器和用品：
可见分光光度计 、 台式离心机 、可调式移液器 、 1 ml 玻璃比色皿 、研钵 、冰和蒸馏水。
NADP+和 NADPH 的提取：
1、血清（浆） 中 NADP+和 NADPH 的提取
NADP+ 的提取：按照血清（浆）体积（ml） ：酸性提取液体积（ml） 为 1 ：5~ 10 的比例（建议取约 0. 1ml 血清（浆），加入 1ml 酸性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 碱性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上 清 ，置冰上待测。
NADPH 的提取：按照血清（浆）体积（ml）：碱性提取液体积（ml）为 1：5~ 10 的比例（建议取约 0. 1ml 血清（浆），加入 1ml 碱性提取液），95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混匀，10000g 4 ℃离心 10min，取上 清 ，置冰上待测。
2、组织中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+ 的提取：按照组织质量（g） ：酸性提取液体积（ml） 为 1 ：5~ 10 的比例（建议取约 0. 1g 组织，加 入 1ml 酸性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃ 离心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 碱性提取液使之中和，混匀， 10000g 4 ℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。
NADPH 的提取：按照组织质量（g） ：碱性提取液体积（ml） 为 1 ：5~ 10 的比例（建议取约 0. 1g 组织， 加入 1ml 碱性提取液），冰浴研磨，95℃水浴 5min（盖紧，以防止水分散失）；冰浴中冷却后，10000g 4 ℃ 离心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混匀， 10000g 4 ℃离心 10min，取上清， 置冰上待测。
3、细胞或细菌中 NADP+和 NADPH 的提取：
NADP+ 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（ 104 个） ：酸性提取液体 积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 酸性提取液） ，超声波破碎（冰浴，功 率 20％或 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次） ，95℃水浴 5min（盖紧， 以防止水分散失） ；冰浴中 冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 碱性提取液使之中和，混匀， 10000g 4 ℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。
NADPH 的提取：先收集细胞或细菌到离心管内，弃上清，按照细菌或细胞数量（104 个）：碱性提取液体 积（ml）为 500~ 1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1ml 碱性提取液） ，超声波破碎（冰浴，功 率 20％或 200W，超声 3s， 间隔 10s，重复 30 次） ，95℃水浴 5min（盖紧， 以防止水分散失） ；冰浴中 冷却后，10000g 4 ℃离心 10min；取 500μl 上清液，加入 500μl 酸性提取液使之中和，混匀， 10000g 4 ℃ 离心 10min，取上清，置冰上待测。
测定步骤：
1、分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 570nm，蒸馏水调零。
2、加样表(在 1.5ml 棕色 EP 管中按下表依次加样）：
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试剂名称(μl) |
对照管 |
测定管 |
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样本 |
50 |
50 |
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试剂一 |
250 |
250 |
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试剂二 |
75 |
75 |
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试剂三 |
75 |
75 |
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试剂四 |
75 |
75 |
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试剂五 |
35 |
35 |
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试剂六 |
500 |
混匀，室温避光静置 20min |
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试剂六 |
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500 |
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试剂七 |
1000 |
1000 |
注意事项
1、如果一次性测定样本数较多，可将试剂一 、二 、三和四按比例配成混合液。
2、对照管和测定管的测定步骤的区别：对照管加完试剂一 、二 、三 、 四和五后必须马上加试剂六；测定 管加完试剂一 、二 、三 、 四和五后必须反应 20min 后再加试剂六。
3、反应过程中注意避光。
4、若 NADP+测定中△A（A2-A1）≤0.0144，NADPH 测定中△A（A2-A1）≤0.0259，说明样本中辅酶含量 较低 ，已低于检测限 ，可做如下调整：
（1）将测定管避光静置时间 20min 延长到 60min；
（2）在提取阶 段增加取样量 ，即取 0.2g 样本或 0.2ml 样本加入 1ml 提取液。
5、由于每一个测定管需要设一个对照管，本试剂盒 50 管保证测 24 个 NADP+或 NADPH。
NADP+和 NADPH 含量的计算：
一、NADP+含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 0. 197x + 0.0144，R2 = 0.9998；其中 y 为△A，x 为 NADP+浓度 nmol/ml
1、血清（浆） 中 NADP+含量计算
NADP+含量(nmol/ml）=[ (△A -0.0144）÷0. 197×V1) ]÷(V3×V1÷V2)
= 101.5×(△A -0.0144）
2、组织 、细菌或细胞中 NADP+含量计算
（1）按样本蛋白浓度计算
NADP+ (nmol/mg prot）=[(△A -0.0144）÷0. 197×V1) ]÷(V1×Cpr)
= 5. 1×(△A -0.0144）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
NADP+ (nmol/g 鲜重）= [(△A -0.0144）÷0. 197×V1)] ÷(W×V1÷V2)
=10.2×(△A -0.0144）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
NADP+ (nmol/104 cell）=[(△A -0.0144）÷0. 197×V1)] ÷(500×V1÷V2)
=0.02×(△A -0.0144）
二、NADPH 含量的计算
标准条件下的回归曲线为 y = 1.2396x + 0.0259，R2 = 0.9977；其中 y 为△A，x 为 NADPH 浓度 nmol/ml
1、血清（浆） 中 NADPH 含量计算
NADPH 含量(nmol/ml）= [(△A -0.0259）÷ 1.2396×V1)] ÷(V3×V1÷V2)
= 16. 1× (△A -0.0259）
2、组织 、细菌或细胞中 NADPH 含量计算
（1）按样本蛋白浓度计算
NADPH (nmol/mg prot）=[ (△A -0.0259）÷ 1.2396×V1)] ÷(V1×Cpr)
= 0.8× (△A -0.0259）÷Cpr
（2）按样本鲜重计算
NADPH (nmol/g 鲜重）=[(△A -0.0259）÷ 1.2396×V1) ]÷(W×V1÷V2)
=1.6× (△A -0.0259）÷W
（3）按细菌或细胞密度计算
NADPH (nmol/104 cell）=[(△A -0.0259）÷ 1.2396×V1) ]÷(500×V1÷V2)
=0.003× (△A -0.0259）
V1：加入反应体系中样本体积，0.05ml；V2：加入提取液体积，2ml；V3：加入血清（浆）体积：0. 1ml； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/ml；W：样本质量，g；500：细胞或细菌总数，500 万。
注意 ：最低检测限为 0.01nmol/ml 或 0.01nmol/g 鲜重 或 0.001nmol/mg prot
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