吲哚乙酸氧化酶活性测定试剂盒说明书（可见分光光度法）

测定意义：

吲哚乙酸 (IAA) 在吲哚乙酸氧化酶的作用下， 被氧化破坏失去活性。植物体内吲哚乙酸氧 化酶活力的大小，对调节体内吲哚乙酸

的水平，起着重要的作用， 而影响植物的生长。

测定原理：

在无机酸存在情况下，吲哚乙酸能与 FeCl3 作用，生成红色螯合物，该物质在 530nm 处有 最大吸收峰，酶活力的大小可以其破坏吲哚乙酸的速度表示之。吲哚乙酸的含量可用比色法 测定。

自备仪器和用品：

低温离心机、 水浴锅、可调节移液器、可见分光光度计/酶标仪、 1.5mL  离心管、 微量玻璃 比色皿/96 孔板、和蒸馏水。

试剂组成和配制：

试剂一：液体 120mL×1 瓶， 4℃保存。

试剂二：液体 10mL×1 瓶， 4℃保存。

试剂三：液体 10mL×1 瓶， 4℃保存。

试剂四：液体 10mL×1 瓶， 4℃保存。

试剂五：液体 2mL×1 瓶， 4℃避光保存。

试剂六： 液体 50mL×1 瓶， 4℃保存。 临用前吸取 1mL 试剂五加入试剂六中混匀， 待用， 避光保存。

粗酶液提取：

1.     组织：按照组织质量(g)：试剂一体积(mL)为 1 ：5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织， 加入 1mL 试剂一)进行冰浴匀浆。8000g ，4℃离心 10min ，取上清置冰上待测。

2.    细菌、真菌：按照细胞数量(10⁴ 个)：试剂一体积(mL)为 500~1000 ：1  的比例(建 议 500 万细胞加入 1mL 试剂一)，冰浴超声波破碎细胞(功率 300w，超声 3 秒，间隔 7秒，总时间 3min)；然后 8000g ，4℃，离心 10min ，取上清置于冰上待测。

3.    血清等液体：直接测定。 

测定操作：

1.  分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长到 530 nm ，蒸馏水调零。

2.  试剂二、试剂三、试剂四置于 25℃(一般物种) 或者 37℃ (哺乳动物) 水浴中保温 20min。

3.  取 1.5mL EP 管若干，操作表如下：

注意： 标准管只需做一次

IAA 氧化酶活性计算公式：

a.    使用微量石英比色皿测定的计算公式如下

IAA 标准曲线公式： y = 1.334x + 0.025    R² = 0.998   (x 为 IAA 浓度， mmol /L；y 为吸光值) 

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：从开始时加入的 IAA 量减去酶作用后残留的 IAA 含量， 即得被酶所催化的 IAA 含量。以每 mg 酶蛋白在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U  (μmol/h/mg prot) =[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷ (V 样×Cpr) ÷T=1.5× (A1-A2) ÷Cpr

2、按样本鲜重计算

酶活定义： 以每 g 样本在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U  (μmol/h/g  鲜重) =[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T =1.5× (A1-A2) ÷W

3、按细胞数量计算

酶活定义： 以每 1 万个细胞在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U  (μmol/h/10⁴ cell) =[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总×W) ÷T =1.5× (A1-A2) ÷细胞数量

4、按液体体积计算

酶活定义： 以每 mL 酶液在 1h 内分解破坏的吲哚乙酸量表示酶活力大小。

U  (μmol/h/mL) =[(A1-0.025) ÷1.334-(A2-0.025) ÷1.334] ×V 样÷(V 样÷V 样总) ÷T =1.5× (A1-A2)

V 样总： 上清液总体积，1mL；V 样：加入反应体系中上清液体积， 20μL=0.02 mL；Cpr： 上清液蛋白质浓度， mg/mL；W：样品质量， g ，T：反应时间， 0.5h。

注意事项：

最低检出限为 0.01μmol/mL。