肉桂醇脱氢酶（CAD）活性检测试剂盒说明书(紫外分光光度法)

产品内容：

提取液：液体 60mL×1 瓶，4℃保存；

试剂一：粉剂×1 瓶，-20℃保存；临用前加入 15mL 试剂三溶解。可溶解后分装-20℃保存，避免反复冻融。

试剂二：粉剂×1 瓶，4℃保存；临用前加入15mL 乙醇混匀，溶解后 4℃保存。

试剂三：液体 50mL×1 瓶，4℃保存。

产品说明：

CAD 是木质素生物合成途径中的关键酶之一，催化香豆醛、芥子醛以及松柏醛等生成与之相应的肉桂醇。该酶多存在于高等植物、酵母、菌类中，研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理，为减少水果石细胞含量提高其品质提供依据。

CAD 催化肉桂醛和 NADPH 生成肉桂醇和 NADP⁺，在 340nm 下测定 NADPH 消耗速率，即可反映CAD 活性。

试验中所需的仪器和试剂：

紫外分光光度计、低温离心机、水浴锅、1mL 石英比色皿、可调式移液枪、研钵/匀浆器、冰、乙醇和蒸馏水。

操作步骤：

一、粗酶液提取：

组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g 组织，加入 1mL提取液）进行冰浴匀浆，然后 10000g，4℃，离心 10min，取上清，置冰上待测。

细菌或培养细胞：先收集细菌或细胞到离心管内，离心后弃上清；按照细菌或细胞数量（10⁴ 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液），超声波破碎细菌或细胞（冰浴，功率 20％或 200W，超声 3s，间隔 10s，重复 30 次）；10000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

二、测定步骤：

1、紫外分光光度计预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2、工作液的配制：将试剂一、试剂二、试剂三按 1:1:2(V:V:V)的比例配制工作液，工作液现用现配。

3、操作表：在 1mL 石英比色皿中分别加入下列试剂：

三、CAD 酶活计算：

1、按蛋白浓度计算

酶活定义：每 mg 组织蛋白每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

CAD 酶活（U/mg prot）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反总÷（V 样×Cpr）÷T= 321.54×△A÷Cpr

2、按蛋白浓度计算

酶活定义：每 g 组织每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

CAD 酶活（U/g 鲜重）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反总÷（V 样×W÷V 样总）÷T=321.54×△A÷W

3、按照细菌或细胞数量计算

酶活定义：每 10⁴ 个细菌或细胞每分钟消耗 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

CAD 酶活（U/104 cell）= △A÷（ε×d）×10⁹×V 反总÷（500×V 样÷V 样总）÷T= 0.643×△A

ε：NADPH 摩尔消光系数，6.22×10³ L/ mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 反总：反应体系总体积，0.001L；V 样：反应体系中样本体积，0.1mL；V 样总：加入提取液体积，1mL；Cpr：样本蛋白浓度，mg/mL，蛋白浓度自行测定；W：样本质量，g，T：反应时间：5min；500：细菌或细胞总数， 500 万；109：单位换算系数，1mol=109nmol。

注意事项：

1、 当 A1 小于 0.8，建议将样品稀释后再进行测定。

2、 空白管为检测各试剂组分质量的检测孔，正常情况下，变化不超过 0.04。