产品名称:4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)测试盒
产品规格:100管/48样,50管/24样
产品货号:YX-C-4CL,YX-W-4CL
免费咨询:0551-66107970
货号 |
产品名称 |
检测方法 |
规格 |
售价(元) |
YX-C-4CL |
4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)测试盒 |
紫外分光光度法 |
50管/24样 |
3000 |
YX-W-4CL |
4-香豆酸:辅酶A连接酶(4CL)测试盒 |
微量法 |
100管/48样 |
2250 |
正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定
测定意义:
4CL 是连接苯丙酸途径与木质素特异合成途径的关键酶,主要催化肉桂酸生成相应的肉桂酸辅酶 A 酯,是合成木质素与其他苯丙烷类化合物的代谢流向调控点。该酶主要存在于高等植物、酵母和菌类中,研究该酶可以探讨多种生物细胞发育过程中木质素沉积的代谢机理, 为减少水果石细胞含量而提高其品质提供依据。
测定原理:
4CL催化4-香豆酸和 CoA 生成 4-香豆酸 CoA,在333nm下测4-香豆酸CoA生成速率,即可反映 4CL活性。
需自备的仪器和用品:
紫外分光光度计、台式离心机、可调式移液器、1mL 石英比色皿、研钵、冰和蒸馏水。
试剂的组成和配制:
提取液:60mL×1 瓶,4℃保存;
试剂一:液体60 mL×1 瓶,4℃保存;
试剂二:粉剂×2 瓶,-20℃保存;
粗酶液提取:
细菌或培养细胞:先收集细菌或细胞到离心管内,离心后弃上清;按照细菌或细胞数量(104 个):提取液体积(mL)为 500~1000:1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液),超声波破碎细菌或细胞(冰浴,功率 20%或 200W,超声 3s,间隔 10s,重复 30 次); 8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
组织:按照组织质量(g):提取液体积(mL)为 1:5~10 的比例(建议称取约 0.1g 组织,加入 1mL 提取液),进行冰浴匀浆。8000g 4℃离心 10min,取上清,置冰上待测。
测定步骤:
1、 分光光度计 40℃预热 30min 以上,调节波长至 333nm,蒸馏水调零。2、 样本测定
(1) 在试剂二中加入 12.5mL 试剂一充分溶解混匀,置于 40℃水浴预热 10min;现配现用
(配好后 24h 内用完);
(2) 测定管:在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂二,混匀,立即记录
333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A2。
对照管:在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂一,混匀,立即记录
333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A1,计算ΔA=A2-A1。
注意:每个测定管设一个对照管。
4CL 活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T= 31.75×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位定义:每g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T= 31.75×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T= 0.063×ΔA
V 反总:反应体系总体积,1×10 -3 L;ε:4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数,2.1×10 4 L / mol /cm; d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.05 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL; T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
2、 样本测定
(1) 在试剂二中加入 12.5mL 试剂一充分溶解混匀,置于 40℃水浴预热 10min;现配现用
(配好后 24h 内用完);
(2) 测定管:在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂二,混匀,立即记录
333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A2。
对照管:在 1mL 石英比色皿中加入 50μL 样本和 950μL 试剂一,混匀,立即记录
333nm 处 40℃反应 30min 后的吸光值 A1,计算ΔA=A2-A1。
注意:每个测定管设一个对照管。
4CL 活性计算:
(1) 按样本蛋白浓度计算:
单位定义:每 mg 组织蛋白每分钟生成 1 nmol4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/mg prot)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(V 样×Cpr) ÷T= 31.75×ΔA÷Cpr
(2) 按样本鲜重计算:
单位定义:每g 组织每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/g 鲜重)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T= 31.75×ΔA÷W
(3) 按细菌或细胞密度计算:
单位定义:每 1 万个细菌或细胞每分钟生成 1 nmol 4-香豆酸辅酶A 定义为一个酶活力单位。
4CL(nmol/min/104 cell)=[ΔA×V 反总÷(ε×d)×10 9]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T= 0.063×ΔA
V 反总:反应体系总体积,1×10 -3 L;ε:4-香豆酸辅酶 A 摩尔消光系数,2.1×10 4 L / mol /cm; d:比色皿光径,1cm;V 样:加入样本体积,0.05 mL;V 样总:加入提取液体积,1 mL; T:反应时间,30 min;Cpr:样本蛋白质浓度,mg/mL;W:样本质量,g;500:细菌或细胞总数,500 万。
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