超氧阴离子(Oxygen free radical, OFR)试剂盒说明书（微量法）

注意：正式测定之前选择2-3个预期差异大的样本做预测定。

测定意义：

生物体内超氧阴离子等活性氧具有免疫和信号传导的作用，但积累过多时会对细胞膜及生物大分子产生破坏作用，导致机体细胞和组织代谢异常，从而引起多种疾病。

测定原理：

超氧阴离子与盐酸羟胺反应生成 NO －，NO －在对氨基苯磺酸和 α －萘胺的作用下，生成红色的偶氮化合物，在 530nm 处有特征吸收峰，根据 A 值可以计算样品中 O －含量，反应式为反应式为NH2OH + 2O2－ ＋H＋ → NO2－ ＋ H2O2 ＋ H2O。
自备实验用品及仪器：

天平、水浴锅、离心机、可见分光光度计/酶标仪、微量石英比色皿/96 孔板、氯仿和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 110mL×1 瓶，4℃保存。

试剂一：液体 8mL×1 瓶，4℃保存。

试剂二：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂三：液体 6mL×1 瓶，4℃避光保存。

试剂四：氯仿，自备。

超氧阴离子提取：

1. 植物、动物组织：按照组织质量（g）：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例（建议称取约 0.1g组织，加入 1mL 提取液）进行冰浴匀浆，然后，10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

2. 细菌、真菌：按照细胞数量（104 个）：提取液体积（mL）为 500~1000：1 的比例（建议 500万细胞加入 1mL 提取液），冰浴超声波破碎细胞（功率 300w，超声 3 秒，间隔 7 秒，总时间 3min）；然后 10000g，4℃，离心 20min，取上清置于冰上待测。

3. 血清或培养液：直接测定。

测定操作表：

1、分光光度计/酶标仪预热 30min，调节波长至 530nm。

2、操作表

a. 用微量石英比色皿测定的计算公式

如下标准曲线：y=0.0115x-0.0038，R2=0.9986
1. 组织：
（1） 按照样本质量计算
超氧阴离子含量（ μ mol/g 鲜重） = (A530+0.0038)÷0.0115×V 反总÷(V 样÷V 样总
×W)×10-3×2
= 1.74×(A530+0.0038)÷W
超氧阴离子产生速率（μ mol/ g·min）=1.74×(A530+0.0038)÷W÷T
=0.087×(A530+0.0038)÷W
（2） 按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量（μ mol/mg prot）= (A +0.0038)÷0.0115×V 反总÷(V 样×Cpr)×10-3×2
=1.74×(A530+0.0038)÷Cpr
超氧阴离子产生速率（μ mol/ mg prot·min）=1.74×(A530+0.0038)÷Cpr÷T
= 0.087×(A530+0.0038)÷Cpr
2. 细菌，真菌：
超氧阴离子含量（µmol/104 cell）= (A +0.0038)÷0.0115× V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞
数量)×10-3×2
= 1.74×(A530+0.0038)÷细胞数量
超氧阴离子产生速率（µmol/mg prot·min）= 1.74×(A530+0.0038)÷细胞数量÷T
= 0.087×(A530+0.0038)÷细胞数量
3. 血清或培养液
超氧阴离子 含 量 （ μ mol/L ） = (A530+0.0038)÷0.0115 × V 反总 ÷V 样 ×2= 1739.13×(A530+0.0038)
超氧阴离子产生速率（μ mol/L·min）= 1739.13×(A530+0.0038) ÷T= 86.96×(A530+0.0038)
V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.4mL；V 样：反应中样品体积，0.04mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2: 2 分子O －参与反应生成 1 分子NO －。
b. 用 96 孔板测定的计算公式如下
标准曲线：y=0.00575x-0.0038，R2=0.9986
1. 组织：
（1） 按照样本质量计算
超氧阴离子含量（ μ mol/g 鲜重） = (A530+0.0038)÷0.00575×V 反总÷(V 样÷V 样总
×W)×10-3×2
= 3.48×(A530+0.0038)÷W
超氧阴离子产生速率（μ mol/ g·min）=3.48×(A530+0.0038)÷W÷T
=0.174×(A530+0.0038)÷W
（2） 按照蛋白质浓度计算
超氧阴离子含量（μ mol/mg prot）= (A +0.0038)÷0.00575×V 反总÷(V 样×Cpr)×10-3×2
= 3.48×(A530+0.0038)÷Cpr
超氧阴离子产生速率（μ mol/ mg prot·min）= 3.48×(A530+0.0038)÷Cpr÷T
=0.174×(A530+0.0038)÷Cpr
2. 细菌，真菌：
超氧阴离子含量（µmol/104  cell）= (A +0.0038)÷0.00575× V 反总÷(V 样÷V 样总×细胞数量)×10-3×2
= 3.48×(A530+0.0038)÷细胞数量
超氧阴离子产生速率（µmol/104 cell·min）= 1.74×(A +0.0038)÷细胞数量÷T
=0.174×(A530+0.0038)÷细胞数量
3. 血清或培养液
超氧阴离子 含量（ μ mol/L ） = (A530+0.0038)÷0.00575 ×V 反 总 ÷V 样 ×2= 3478.26×(A530+0.0038)
超氧阴离子产生速率（μ mol/L·min）= 3478.26×(A530+0.0038) ÷T= 173.91×(A530+0.0038) V 样总：加入提取液体积，1 mL； V 反总：反应总体积，0.4mL；V 样：反应中样品体积，0.04mL； Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL；W：样品质量，g；T：反应时间，20min；2：2 分子O2－参与反应生成 1 分子 NO2－。
注意事项：
1、OD 值大于 1.5，样品适当稀释再测定，注意计算公式里乘以稀释倍数。
2、样品制备好后，立刻进行测定，请勿将样品进行长时间的低温保存，以免影响测定结果。
3、试剂四有一定的毒性，请操作时做好防护措施。
4、最低检出限为 13.3µmol/L。