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简介：

醋酸（醋酸盐）广泛存在于各种食品和饮料中，也存在于许多其他材料中，如纸张、药品和工业产品中。在葡萄酒工业中，它是最重要的质量参数之一，并在整个酿造过程中进行测量。这种先进的试剂盒（K-ACET）受益于大大延长的保质期，因为乙酰辅酶A合成酶（ACS）是作为高度稳定的即用硫酸铵悬浮液而不是作为冻干粉末提供的。聚乙烯吡咯烷酮（PVP）也被纳入了检测中，以防止特别是红葡萄酒中发现的特殊单宁的干扰。

推荐用于手动分析，另外两个试剂盒已针对自动分析应用进行了优化；K-ACATF已将校准线性扩展至30μg/mL（在最终分析中），并受益于稳定系统，该系统可显著降低制备试剂的劣化率（吸光度增加），一些其他产品也存在的问题；K-乙酰化钾是一种基于醋酸盐激酶的新的分析方法。由于在这种情况下不涉及指示剂反应，吸光度化学计量比随醋酸量的变化而变化，从而产生良好的线性校准（R>0.999）。

原则：

腺苷存在下的乙酰辅酶A合成酶（ACS）-

5'-三磷酸（ATP）和辅酶A（辅酶A）将乙酸（醋酸盐）转化为乙酰辅酶A（1），形成5'单磷酸腺苷（AMP）和焦磷酸盐。柠檬酸合成酶（CS）在乙酰辅酶a存在下，将草酰乙酸转化为柠檬酸（2）。反应（2）所需的草酰乙酸是由L-苹果酸和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）在L-苹果酸脱氢酶（L-MDH）（3）存在下形成的。在这个反应中，NAD被还原成NADH。++

（ACS）

（一）醋酸+ATP+CoA乙酰辅酶A+AMP+焦磷酸盐

（CS）

（二）乙酰辅酶A+草酰乙酸+HO柠檬酸+CoA2

（L-MDH）

（三）L-苹果酸盐+NAD草酰乙酸+NADH+H的测定基于NADH的形成，NADH通过340nm处的吸光度增加进行测量。由于前面的反应是一个平衡反应，因此必须根据第6页的方程式计算乙酸的含量。++

特异性、灵敏度、线性和精密度：

这项化验是针对醋酸的。

分析的最小区分吸光度为0.005吸光度单位。这相当于0.07 mg/L样品溶液，*样品体积为2.0 mL（或1.4 mg/L，样品体积为0.1 mL）。检出限为0.14mg/L，吸光度差为0.010，*样品体积为2.0mL。

在每次测定0.3至20μg醋酸的范围内，测定呈线性。在使用一种样品溶液进行两次测定时，可能出现0.005到0.010的吸光度差。当样品体积为2.00 mL时，相当于约0.07至0.14 mg/L样品溶液的乙酸浓度。Beutler发布了一系列样品的再现性数据，各种样品的c.v.值在0.6%到2.8%之间。如果在样品制备过程中对样品进行稀释，则将结果乘以稀释系数F。如果在样品制备过程中对样品进行称重，例如10 g/L，则可预期差值为0.02至0.05 g/100 g。1

干扰：

乙酸酯类（如乙酸乙酯）通常存在于乙酸存在下。乙酸乙酯在分析条件下缓慢水解，并负责“蠕变”反应。通过将A值外推到ACS加入的时间，可以消除乙酸酯类的影响。通过在16分钟和20分钟读取额外的吸光度读数，并使用基于MegaCalc Excel的计算工具（可从Megazyme网站上免费获得）来执行此操作。修正后的A值将提供乙酸浓度。总醋酸盐浓度（包括酯类）可通过允许反应达到终点（直到吸光度值稳定）来确定。2TM公司2

如果醋酸的转化在试验规定的时间内（约10-12分钟）完成，一般可以得出结论，没有发生任何干扰。但是，可以通过在反应完成后向反应杯中添加乙酸（0.1 mL中约10μg）来进一步检查。吸光度显著增加。

分析样品中的干扰物质可通过包括内标物来鉴别。本标准的定量回收率有望实现。样品处理和提取过程中的损失通过进行回收实验来确定，即在最初的提取步骤中向样品中添加乙酸。

安全性：

应遵守适用于所有化学物质的一般安全措施。

有关本产品安全使用和处理的更多信息，请参阅Megazyme网站上的相关SDS。

套件：

Megazyme提供了适合进行53次测定的试剂盒。试剂盒包含完整的分析方法以及：

瓶子1：缓冲液（30ml，pH8.4）加L-苹果酸和叠氮化钠（0.02%w/v）作为防腐剂。在4℃下稳定2年以上。

瓶2：（x2）NAD加ATP、PVP和CoA。+

冻干粉。

在-10℃以下稳定5年以上。

试剂溶液/悬浮液的制备：

1. 使用提供的瓶子1的内容物。在4℃下稳定2年以上。

2. 将瓶2的内容物溶解在5.5 mL蒸馏水中。分为适当大小的等分试样，并在使用期间储存在-10°C以下的聚丙烯管中，如有可能，在使用过程中保持冷却。一旦溶解，试剂在-10°C以下稳定2年以上。在需要之前不要溶解*瓶的内容物。

3号和4号。使用提供的瓶子3和4的内容物。在*次打开之前，摇动瓶子以除去可能在橡胶塞上沉淀的任何酶。随后，将瓶子直立存放。使用前，将瓶子搅匀。在4℃下稳定2年以上。

5. 使用提供的瓶子5的内容物。在4℃下稳定2年以上。

注：注：乙酸标准溶液仅在对所用分光光度计的准确度有疑问或怀疑样品中的物质引起抑制时进行测定。乙酸的浓度直接由NADH的消光系数确定（见第6页）。

设备（推荐）：

1.      100 x圆底玻璃管（16 mm）。

2. 一次性塑料试管（1厘米光程，3.0毫升）。

3. 微型移液器，例如Gilson Piptman（20μL和100μL）。®

4. 容积式移液器，如Eppendorf Multipette®

- 使用5.0 mL Combitip（分配0.2 mL NAD/ATP/PVP/CoA溶液）。®+

- 使用25 mL Combitip（分配2.0 mL蒸馏水和0.5 mL小份缓冲液）。®

5. 分析天平。

6. 分光光度计设置为340nm。

7. 涡流混合器（如IKA Yellowline试管振荡器TTS2）。®

8. 停车钟。

9. 沃特曼1号（9厘米）滤纸。

程序：

逆风阅读（光路中没有反应杯）或者对着水

*例如，用塑料抹刀或在用反应杯盖或副膜密封反应杯后轻轻倒置。®