规格：100 管/96 样

正式测定前务必取 2-3 个预期差异较大的样本做预测定

测定意义：

莽草酸途径是存在于植物、真菌和微生物中的一条重要的代谢途径， 莽草酸脱氢酶是莽草酸 合成途径中的关键酶。

测定原理：

莽草酸脱氢酶催化莽草酸和 NADP 产生 NADPH，检测 340nm 下的吸光值增加速率来表示 SD 活性。

需自备的仪器和用品：

紫外分光光度计/酶标仪、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、 研钵、冰和蒸馏水。

试剂组成和配制：

提取液：液体 100mL×1 瓶，  4℃保存；

试剂一：液体 25mL×1 瓶，  4℃保存；

试剂二：粉剂×2 瓶，4℃保存；

粗酶液提取：

细菌或培养细胞：  先收集细菌或细胞到离心管内，  离心后弃上清；  按照细菌或细胞数量  (104 个)：提取液体积(mL)为 500~1000：  1 的比例(建议 500 万细菌或细胞加入 1mL 提取液)  ，超声波破碎细菌或细胞(冰浴，  功率 20％或 200W，超声3s，间隔 10s，重复 30 次)；  8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

组织：  按照组织质量(g) ：提取液体积(mL)为 1：5~10 的比例(建议称取约 0. 1g 组织， 加入 1mL 提取液)，进行冰浴匀浆。  8000g 4℃离心 10min，取上清，置冰上待测。

测定步骤：

1 、   分光光度计或酶标仪预热 30min 以上，调节波长至 340nm，蒸馏水调零。

2 、   样本测定

(1) 在试剂二中加入 10mL 试剂一充分溶解混匀，  置于 37℃ (哺乳动物) 或 25℃ (其它物 种)水浴 5min，现配现用。

(2)在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μL 样本和 190μL 试剂二， 混匀，立即记录 340nm 处 20s 时的吸光值 A1 和 5min20s 后的吸光值 A2，计算 ΔA=A2-A1。

SD 活性计算：

a.用微量石英比色皿测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

SD (nmol/min/mg prot)  ＝[ΔA×V 反总÷  (ε×d)  ×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=643×ΔA÷Cpr 

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

SD  (nmol/min/g  鲜重)  ＝[ΔA×V 反总÷  (ε×d)  ×109]÷(W ×V 样÷V 样总) ÷T=643×ΔA÷W 

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

SD  (nmol/min/104 cell)  ＝[ΔA×V 反总÷  (ε×d)  ×109]÷(500×V 样÷V 样总) ÷T=1.286×ΔA   

V 反总：反应体系总体积，  2×10-4  L；ε ：NADH 摩尔消光系数，  6.22×103  L / mol /cm；  d： 比色皿光径，  1cm；V 样：加入样本体积，  0.01mL；V 样总：加入提取液体积，  1 mL；  T： 反应时间，  5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，  mg/mL；W：样本质量，  g；500：细菌或细胞总 数，  500 万。

b.用 96 孔板测定的计算公式如下

(1)按样本蛋白浓度计算：

单位的定义：每 mg 组织蛋白每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

SD  (nmol/min/mg prot)  ＝[ΔA×V 反总÷  (ε×d)  ×109]÷(V 样×Cpr) ÷T=1286×ΔA÷Cpr 

(2)按样本鲜重计算：

单位的定义：每 g 组织每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。

SD  (nmol/min/g  鲜重)  ＝[ΔA×V 反总÷  (ε×d)  ×109]÷(W× V 样÷V 样总) ÷T=1286×ΔA÷W

(3)按细菌或细胞密度计算：

单位的定义：每 1 万个细菌或细胞每分钟产生 1 nmol 的 NADPH 定义为一个酶活力单位。 

SD  (nmol/min/104 cell)  ＝[ΔA×V 反总÷  (ε×d)  ×109]÷(500×V 样÷V 样总)÷T=2.572×ΔA

V 反总：反应体系总体积，  2×10-4  L；ε ：NADH 摩尔消光系数，  6.22×103  L / mol /cm；  d： 96 孔板光径，0.5cm；V 样：  加入样本体积，  0.01 mL；V 样总：  加入提取液体积，  1 mL；T： 反应时间，  5 min；Cpr：样本蛋白质浓度，  mg/mL；W：样本质量，  g；500：细菌或细胞总 数，  500 万。